Resumen:
Una amplia variedad de procesos inflamatorios transcurre a valores acídicos de pH extracelular, en un rango de pH comprendido entre 6.0 y 7.0. Los procesos infecciosos de naturaleza bacteriana tienden a desarrollar ambientes acídicos en tejidos periféricos. Los procesos alérgicos y, particularmente, el asma alérgico, así como también diferentes afecciones autoinmunes suelen inducir la acumulación de protones en los tejidos afectados. El crecimiento de tumores sólidos se asocia también al desarrollo de ambientes acídicos, cuyos valores de pH han mostrando extenderse en el rango 5.5-7.0. Pese a la multiplicidad de procesos que transcurren en entornos acídicos, es poco lo que comprendemos acerca del impacto que imponen altas concentraciones de protones a la respuesta inmune. El objetivo de la presentación será brindar un resumen de nuestra experiencia en este campo, centrado en el análisis del impacto que impone el pH extracelular a la función de neutrófilos, monocitos y células dendríticas, así como también a diferentes sistemas humorales que participan en el desarrollo de procesos inflamatorios.  

Contacto: jorgegeffner@gmail.com
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Resumen:
Los Linfocitos T CD4+ (Th) pueden diferenciarse a una variedad de subpoblaciones efectoras que producen citoquinas involucradas en la regulación de la respuesta inmune. En los peces, la existencia y función de los linfocitos Th ha sido muy pobremente caracterizada y la existencia de subpoblaciones no se ha demostrado, principalmente debido a la falta de anticuerpos contra marcadores (i.e. CD4, CD3 entre otros) y contra citoquinas. Para demostrar la presencia de los linfocitos Th y de su respuesta en salmónidos, primero analizamos la expresión de genes de citoquinas, y del procesamiento y presentación de antígenos en salmones de familias resistentes y susceptibles a la infección por el virus IPN (por sus siglas en inglés, infectious pancreatic necrosis virus). Los resultados mostraron la expresión de genes como ifn-g, il-12, il-10 y tgf-b, lo que sugirió la presencia y participación de los linfocitos Th en la respuesta a IPNV. Una menor respuesta de los genes de presentación antigénica se correlacionó a susceptibilidad y una respuesta inflamatoria moderada mediada por IFN-g y genes regulatorios se correlacionó a resistencia a la infección. En segundo lugar, desarrollamos anticuerpos anti-CD4 y anti-CD3 de trucha, y analizamos la expresión génica de las células CD4⁺CD3⁺ aisladas. Los resultados constituyen la primera evidencia directa de la presencia de linfocitos Th en los salmónidos. Además, se encontró que los linfocitos Th residen en el bazo, riñón, branquias y timo de las truchas, responden a antígenos virales, producen IL-4/13A y contienen los receptores de esta citoquina, lo que sugiere la presencia de linfocitos tipo Th2 en los peces. Financian RCUK MR-N02526X-1, Fondecyt1161015, DICYT021640IB_postdoc, Basal USA1498, Basal USA1555-VRIDEI 021743lB_cont.

Contacto: monica.imarai@usach.cl
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Resumen:
Los inflamasomas son complejos que inducen la liberación de IL1beta.  Estos complejos juegan un rol importante en la inmunidad antiviral. Se ha establecido que la IL-1beta es crucial para establecer una respuesta antiviral T CD8 apropiada. Sin embargo, el papel de la activación del inflamasoma en la infección por coronavirus no ha sido estudiado. Nosotros nos hemos enfocado en la asociación entre el inflamasoma y la inmunidad antiviral, en un modelo de hepatitis por coronavirus (MHV-A59). Además, nuestro equipo ha demostrado que Tmem176b es un canal que inhibe la activación del inflamasoma NLRP3. Realizamos infecciones in vitro e in vivo con ratones WT, Tmem176b-/- y caspasa-1 KO. Analizamos diferentes parámetros inmunológicos y la sobrevida de los ratones infectados. Nuestros resultados muestran que BMDC infectadas in vitro secretan IL1beta de manera dependiente de caspasa-1 y NLRP3. Además, las BMDCs Tmem176b-/- producen más IL1beta y caspasa 1 que las BMDC WT. En estudios in vivo, ratones Tmem176b-/-  infectados muestran una menor sobrevida, mayores niveles de IL-1beta y caspasa-1 y elevada carga viral en relación a ratones Tmem176b+/+.  El bloqueo de IL1beta en animales Tmem176b-/-,  extiende su sobrevida significativamente, y esta mejora es dependiente de células T CD 8. Por otra parte, los ratones Caspasa-1 KO  son más resistentes a la  infección que los WT y muestran una carga viral menor.  Estas diferencias también fueron caracterizadas como T CD8 dependientes mediante ensayos de depleción. Finalmente, determinamos que la células T CD8 especificas expresaron mayor porcentaje de  PD-1 tanto en ratones Tmem176b-/-, como en los caspasa-1 KO en comparación con los WT. Nuestros resultados sugieren que en la infección por coronavirus la IL1beta antagoniza la respuesta inmune antiviral mediante la inactivación funcional de linfocitos T CD8 a través de PD-1. Entender esta interacción es un paso importante en el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas.

Contacto: maiduve@pasteur.edu.uy
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Resumen:
Salmonella sigue siendo una alternativa para el tratamiento de melanoma dada su capacidad de inducir una fuerte activación de la respuesta inmune, su bajo costo de producción y carencia de efectos secundarios, entre otras tantas ventajas. Si bien ya se ha demostrado su efecto antitumoral en varios tipos de tumor, las bases que lo subyacen no están completamente elucidadas. En este trabajo nos centramos particularmente en el inflamasoma, un complejo multiproteico que dados diferentes estímulos promueve la activación de caspasa-1 que a su vez madura IL1β e IL18. Se sabe que Salmonella es capaz de activar el inflamasoma por al menos dos vías: activación de NLRC4 mediante flagelina citosólica, y/o activación de NLRP3 mediante una señal aún no identificada. Si bien la línea B16F1 (melanoma murino no metastásico) no presenta estos receptores, encontramos que nuestra cepa de trabajo (LVR01) induce la activación de caspasa-1 en éstas células. No se observan cambios significativos en la producción de IL18 en sobrenadantes de cultivo por acción de Salmonella. Por su parte, a nivel intratumoral encontramos todos los mensajeros correspondientes al inflamasoma, viéndose aumentados por el tratamiento nlrp3, nlrc4 e il1b. Finalmente utilizamos ratones knock out para diferentes componentes del inflamasoma en los que evaluamos el curso del tratamiento de melanoma subcutáneo con una dosis de LVR01. Los resultados muestran que la activación del inflamasoma es imprescindible para que Salmonella pueda ejercer su efecto antitumoral, en vista de que ratones caspasa-1 ko no exhiben mejora alguna luego del tratamiento. Actualmente estamos intentando refinar el mecanismo subyacente realizando estos mismos ensayos con ratones nlrp3 ko. Dado que los tratamientos antitumorales que involucran de bacterias se apoyan en resultados empíricos, esperamos que el conocimiento generado en este trabajo contribuya al diseño más racional de inmunoterapias basadas en Salmonella.

Contacto: amonaco@higiene.edu.uy
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Resumen:
El centrosoma es el principal centro organizador de microtubulos de la célula. Como tal, cumple roles esenciales en el mantenimiento de su integridad estructural, polaridad, transporte, movimiento y señalización; durante la mitosis, organiza, mueve y segrega los cromosomas. El centrosoma está formado por dos barriles de microtubulos de tamaño definido; los centriolos, rodeados de una matriz proteíca que le adscribe al centrosoma su capacidad de nuclear microtubulos. Por sus roles centrales en la vida de la célula, el número, posición, integridad estructural y composición proteica del centrosoma son altamente regulados. En células de mamífero los centriolos miden 250 x 500 nm, mientras que en eucariotas unicelulares pueden medir 200 x 200 nm. Debido a su pequeño tamaño, la microscopia de súper-resolución (SR) ha permitido avanzar significativamente en el entendimiento molecular, estructural y funcional del centrosoma en múltiples organismos. Defectos del centrosoma han sido asociados a múltiples enfermedades humanas; frecuentemente se observan centrosomas súper-numerarios o estructuralmente aberrantes en cáncer y ciliopatías. Utilizando SIM-SR hemos podido distinguir los extremos basales de centriolos supernumerarios contiguos, indistinguibles por microscopia óptica tradicional, pudiendo determinar que una de las fuentes de  generación de centrosomas supernumerarios en líneas celulares cancerígenas deriva de la superproducción de nuevos centriolos, y de la fragmentación de centriolos largos. En parásitos Apicomplexa, agentes causales de malaria, toxoplasmosis, y criptosporidiosis, el centrosoma cumple un rol esencial en la coordinación espacio-temporal de los procesos de división celular. La mitosis nuclear y la generación interna de nuevas células hijas se encuentran coordinadas temporalmente por anclajes físicos al centrosoma. Utilizando SIM-SR hemos podido identificar sub-dominios, funcionalmente distinguibles, dentro del centrosoma Apicomplexa cuya manipulación genética permite desacoplar éstos procesos, derivando en ciclos celulares fútiles. Estas peculiaridades evidencian una divergencia estructural y funcional potencialmente explotable en el desarrollo de estrategias anti-parasíticas.  

Contacto: mfrancia@pasteur.edu.uy
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Resumen:
El reconocimiento y procesamiento del daño genético implica modificaciones epigenéticas en la cromatina. La más estudiada es la fosforilación de la histona H2AX (variante de H2A) en serina-139 generando γH2AX en respuesta a rupturas de doble cadena en el ADN o regiones simple hebra asociadas a bloqueos de horquillas de replicación. La misma se expande 1-2 Mb alrededor de la lesión permitiendo su inmunodetección como foci de γH2AX. La resolución óptica alcanzable por microscopía de fluorescencia convencional limita la visualización de los foci a regiones nucleares elípticas de intensidad homogénea. En este trabajo investigamos la subestructura de foci de γH2AX a escala nanométrica por dSTORM (direct stochastic optical reconstruction microscopy) en cultivos de células HeLa bajo condiciones control o expuestos al agente radiomimético bleomicina. Esta metodología se basa en la lectura temporal aleatoria y el posicionamiento de las emisiones de fluoróforos individuales utilizando colorantes que experimentan photoswitching reversible y la posterior reconstrucción de una imagen de súper-resolución a partir de todas las localizaciones de molécula única detectadas luego de múltiples ciclos consecutivos de photoswitching y registro. Las imágenes dSTORM revelaron agrupamientos de señal de γH2AX separados por áreas desprovistas de marcación dentro de los foci de γH2AX usualmente observados por microscopía de fluorescencia convencional así como señales tipo dots fuera de los foci distribuidos en todo el volumen nuclear, tanto en controles como en células expuestas a bleomicina. Para determinar la especificidad de la señal de γH2AX utilizamos inhibidores específicos para ATM, ATR y DNA-PK, las quinasas que fosforilan H2AX a γH2AX luego de la inducción de daño. Si bien constatamos la eliminación de los foci de γH2AX al inhibir simultáneamente todas las quinasas no observamos una disminución significativa de la marcación pan-nuclear tipo dots respecto a la presente en cultivos no expuestos a inhibidores. 

Contacto: pabloliddle@gmail.com
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Resumen:
Versatile microscopic techniques have been integrated into the workflow of live science laboratories in recent years, not only in Europe, Asia, or North America, but also within the southern cone. On one side, novel techniques have driven the barrier of resolution beyond the diffraction limit of optical microscopy. On the other side, special illumination techniques like light sheet microscopy have broadened the flied of observation or enhanced the spatial-temporal acquisition frequency for whole organism in vivo observations. This presentation focuses on advances in fluorescence techniques that have been combined with data processing frameworks for storage, analysis, or physical-computational modelling, to broaden the spectrum of available techniques for biomedical research and development within the region. Facilities like the Network for Advances Scientific Equipment (REDECA, http://redeca.med.uchile.cl) provide a variety of scientific techniques and services to foster science, innovation, and education beyond the regional limits. Pros and cons of Spinning Disk Microscopy (SDM), Large Scale Imaging (LSI), Whole Slide Imaging (WSI), and different super resolution techniques will be discussed in combination with benefits and limits of 4-lens Laser Scanning Microscopy (4-lens LSM). Applications will be presented for the observation of migration during epiboly in teleosts and neural crest (NC) cell migration in developmental biology, in addition to applications in the field of neuroscience, microbiology, and cell biology. Finally, a regional platform for tele-pathology and tele-education VirtualMicro (vm.scian.cl) will be presented; the impact of pilot courses for education will be discussed.

Contacto: shartel@med.uchile.cl
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Resumen:
The nutritional status of the mother during gestation can modify fetal development decreasing birth weight that determined long-term alterations in adult life. A restriction of nutrients during pregnancy has been shown to cause infertility in adult males. The effects depend on when subnutrition occurs. However, the mechanisms that trigger fetal programming events have not yet been elucidated. Within the plausible molecules that produced these changes are heath shock proteins (HSPs) that are linked in the testis, to the stabilization and activation of post-meiotic kinases, throughout development of the gonads, with essential role in the process of spermatogenesis. Our hypothesis suggests that subnutrition during key developmental periods, will affects the expression of HSP90ß isoform. The objective was to characterize and quantify the expression of HSP90ß in testis of adult’s rats whose mothers were sub nourished during pregnancy, lactation or during both pregnancy and lactation periods. Testes were formalin fixed and paraffin embedded, and processed for immunohistochemical analyses against HSP90ß protein. HSP90ß protein immunostaining area and intensity were measured. The results were expressed as mean ± SEM, P <0.05. The immunoexpression of HSP90ß was localized in the cytoplasm of spermatogonia, spermatocytes and in the acrosome region in round spermatids. The HSP90ß immunostaining area (%) decreased in sub nourished groups compared with control, being even lower in the sub nourished during pregnancy and lactation (p <0.001). Recently it was shown that in HSP90 knockout mice testis, spermatocytes underwent apoptosis. In conclusion the expression of HSP90ß in the testis is modified in subnutrition conditions, resulting in a greater decrease when it is extended during gestation and lactation developmental periods. The decrease observed in HSP90 could compromise the maintenance of spermatogenesis and for survival of spermatocytes in adult testis.

Contacto: gpedrana@gmail.com
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Resumen:
Alitta succinea (Leuckart 1847) presenta las características morfológicas comunes de la familia Nereididae, así como el proceso de epitoquia asociado a la reproducción sexual. Las modificaciones estructurales que se producen en la epitoquia permiten identificar individuos átocos (inmaduros) y epítocos (maduros). En poblaciones del Mar del Norte, la epitoquia y el comportamiento reproductivo se han asociado con el aumento de la temperatura del agua. En Uruguay, se ha documentado la ocurrencia del comportamiento reproductivo en los meses de octubre a marzo en Punta del Este. Con el objetivo de aportar al conocimiento del ciclo reproductivo de A. succinea en la costa uruguaya, se realizó un análisis del estado reproductivo entre marzo y diciembre de 2015. Se estudiaron dos poblaciones: una de Punta Ballena (34,91°S 55,05°O) y la otra del Puerto de Punta del Este (34,96°S 54,95°O). Estos dos sitios son lugares cercanos geográficamente, cuya diferencia principal es el sustrato sobre el cual se encuentran los animales. Se cuantificó la abundancia, el tamaño y la proporción de epítocos. Se encontró una relación inversa entre la abundancia y las variables temperatura y conductividad. Se encontraron sólo individuos átocos en las muestras de marzo a julio. La presencia de epítocos en baja proporción, entre agosto y diciembre, se relaciona positivamente con la temperatura. Además, el análisis de tamaños (longitud L3) permite diferenciar las muestras de agosto a diciembre de las anteriores (valor medio mayor y rango más amplio). Al comparar las dos poblaciones, la abundancia es similar en cada mes. El análisis de tamaños, muestra diferencias significativas en el mes de junio: valor medio y rango menores en Punta Ballena. Las muestras de julio, por otro lado, no presentan diferencias significativas. Como perspectiva, se propone complementar el análisis del estado reproductivo con una aproximación histológica.

Contacto: jimenamtg@gmail.com
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Resumen:
La utilización de la técnica histoquímica para la citocromo oxidasa permite poner en evidencia la representación neural de las vibrisas de los roedores a nivel de la corteza somatosensorial. El patrón observado se asemeja a una malla de manchas oscuras (barriles), con una estructura de entre cuatro y nueve barriles por fila. Esto constituye un excelente modelo para el análisis de los cambios en la organización celular y circuital del sistema nervioso asociados a patologías del neurodesarrollo, y requiere de herramientas informáticas que permitan procesar y cuantificar de forma rápida alteraciones de la estructura y patrón de los barriles en diferentes condiciones experimentales. Este trabajo presenta un procedimiento semi-automático para la medida de parámetros que buscan cuantificar la topología de las diferentes organizaciones de la regiones de interés en la estructura de malla. Primero se propone un método para la segmentación automática de las regiones en la estructura de la malla. Este método obtiene una primera segmentación gruesa de los barriles a través de una ecualización de histograma, filtrado pasabanda y umbralización local. Luego, cada región obtenida limita una curva que es utilizada como condición inicial para un refinamiento de la segmentación mediante Geodesic Active Contours. En esta etapa, el usuario valida la segmentación obtenida y define un barril específico de forma de poder ajustar la malla. Finalmente, una vez obtenidos los centroides de los diferentes barriles y la relación topológica entre ellos se busca cuantificar su organización estructural por medio de diferentes parámetros como son: distancia entre centroides, distancia entre barriles, área, perímetro y forma de los barriles, perfil de variación de intensidad de gris por fila, entre otros. Queda pendiente la extracción de estos parámetros así como su análisis estadístico para evaluar la significatividad de estas medidas en diferente condiciones experimentales.

Contacto: mramos@fing.edu.uy
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Resumen:
Las cilias primarias son organelos celulares especializados que funcionan como sensores de señales extracelulares. Resultados recientes de nuestro grupo mostraron que son necesarias para la proliferación y supervivencia de progenitores retinianos y para la generación de células ganglionares de la retina en el pez cebra. Otro tipo celular esencial de la retina, los fotorreceptores, presentan en su extremo apical una cilia modificada que compone el segmento externo y, en humanos, un síntoma recurrente en varias ciliopatías es la degeneración de la retina dada por la muerte de fotorreceptores. La diferenciación del segmento externo se produce hacia el final de la histogénesis retiniana, y la cilia se localiza apicalmente desde que este proceso comienza. Pero, ¿qué sucede en etapas previas en la diferenciación de fotorreceptores? En una primera aproximación, hemos analizado, mediante microscopía confocal y microscopía electrónica de transmisión (MET), la presencia y localización de cilias primarias en progenitores retinianos ubicados en la zona apical de la retina de embriones tempranos de pez cebra (entre 35 y 48 horas post-fecundación). Utilizando un marcador temprano de fotorreceptores (Crx:mCherry-CAAX), y un marcador de cilia (Arl13b-EGFP), hemos observado que los progenitores que dan lugar a fotorreceptores nunca se desprenden de la superficie apical y que, salvo durante la mitosis, siempre presentan una pequeña cilia de localización apical. Paralelamente, mediante MET hemos detectado la presencia de cilias primarias en la región apical de células con morfología de fotorreceptores en desarrollo. Estas cilias suelen carecer de un bolsillo ciliar, a diferencia de lo que se ha descrito para células neuroepiteliales. Nuestros resultados indican que la cilia primaria está presente en etapas tempranas de la diferenciación de fotorreceptores, y nos preguntamos si es a partir de esta cilia temprana que se desarrolla el segmento externo, así como qué función cumple en la diferenciación celular.

Contacto: mrodao@fcien.edu.uy
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Resumen:
La leptospirosis es una enfermedad bacteriana zoonótica causada por especies patógenas del género Leptospira. Existe muy poca información relacionada a la interaccion Leptospira/DC y la posterior generación de respuestas celulares T. Nosotros generamos bacterias recombinantes para el antígeno modelo OVA: una saprófita, L. biflexa Patoc-OVA (LBP-OVA), y una patógena, L. interrogans Manilae-OVA (LIM-OVA). Se realizaron ensayos de presentación de las bacterias por BMDCs murinas a células T CD4+ de ratones OT-II. Encontramos que, mientras LBP-OVA es capaz de inducir la proliferación y producción IFN-γ por linfocitos T CD4+, esta respuesta está abolida con LIM-OVA. Sugiriendo que la bacteria patógena es capaz de evitar su presentación a células T CD4+ y/o la proliferación de las mismas. Se demostró que ambas bacterias son capaces de inducir la maduración y producción de citoquinas por parte de BMDCs, y no afectan la proliferación de linfocitos T CD4+ en respuesta a BMDCs pulsadas con el péptido mínimo OVA reconocidos por los linfocitos T CD4+ OT2. Estos resultados sugieren que LIM podría impedir alguna etapa del procesamiento antigénico en la via del MHCII. Resultados de medida del pH fagolisosomal de BMDCs infectadas con las bacterias muestran que LIM es capaz de evitar la acidificación de este compartimiento, un mecanismo que evitaría su presentación y explicaría los resultados encontrados antes. Para profundizar estas observaciones utilizamos BMDCs Tmem176b-/-. Tmem176b es un canal ionico fagosomal que promueve la acidificación de este compartimento. Observamos que las BMDC Tmem176b-/- fallaron en inducir la proliferación de linfocitos T CD4+ OT2 cuando se infectaron con LBP-OVA. Ademas, estas BMDC no lograron acidificar el fagosoma conteniendo a LBP. Las especies patógenas de Leptospira podrían escapar de respuestas T CD4+ al manipular la acidificación fagosomal en DCs. 

Contacto: frammauro@pasteur.edu.uy
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Resumen:
Los vectores lentivirales (LVs) tienen un enorme potencial en medicina para corregir defectos genéticos, modificar o prevenir una enfermedad. En este caso se apunta a utilizar un modelo lentiviral de importancia en vacunas para ser utilizado como vehículo para el direccionamiento de antígenos a células presentadoras de antígeno (APCs). Para lograrlo, se mutan sitios específicos de las proteínas virales anulando su especificidad y se incorporan elementos de unión que confieren un nuevo tropismo. Si bien existen distintos sistemas de pseudotipado, uno que ha cobrado gran importancia últimamente es el pseudotipado con la envoltura viral de sarampión (MV), que consta de una proteína de fusión F y una proteína de unión H que ha sido mutada para eliminar su tropismo natural (Hmut). En este proyecto se propone dirigir el tropismo de LV-MV incorporando el dominio variable (nanobodies o VHHs) de anticuerpos carentes de cadena liviana de camélidos fusionados a Hmut. Actualmente se generaron LV-MV decorados con Hmut-VHH anti-CD11b, anti-CD11c, anti-MHCII y anti-toxina tetánica (control). Se ha optimizado su producción obteniendo títulos de 10⁷-10⁸ partículas virales/mL mediante RTqPCR. Se ha logrado la transducción dirigida mediada por nanobodies de células dendríticas derivadas de médula ósea y de la línea celular de macrófagos de ratón J774A.1. En general el porcentaje de transducción es bajo y variable respecto al pseudotipado (de amplia especificidad) obtenido con VSVg (proteína de envoltura del virus de la estomatitis vesicular) usado como referencia. A los efectos de mejorar la eficiencia de transducción, estamos optimizando distintas etapas en la generación de los LVs (relación de Hmut/F), controlándolas mediante citometría de flujo y hemos puesto a punto un ensayo para medir en tiempo real la unión de las partículas lentivirales pseudotipadas con VHHs al ligando correspondiente mediante interferometría de biocapa (BLItz).

Contacto: diegoperez@fq.edu.uy
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Resumen:
La atrazina es uno de los pesticidas más utilizados en todo el mundo y su monitoreo en el agua tiene implicancias relevantes para la salud humana. Nuestro grupo ha desarrollado inmunoensayos no competitivos usando péptidos que reconocen un inmunocomplejo formado por atrazina-anticuerpo monoclonal. Inicialmente los péptidos aplicados se encontraban representados en la superficie de partículas de fagos, pero debido a su carácter de reactivo biológico infectivo, recientemente, desarrollamos inmunoensayos no competitivos con péptidos libres de fagos. El nuevo reactivo lo denominamos Nanopeptámero y consistió en aplicar a los péptidos anti-inmunocomplejos de forma sintética, biotinilados y formando una estructura tetrámerica con estreptavidina. La tecnología “AlphaLisa” es una alternativa de ensayo homogéneo que puede ser aplicado a cualquier inmunoensayo en desarrollo como un formato rápido y automatizable. Se basa en un sistema comercial de dos beads, una aceptora y otra dadora, que generan una señal quimioluminiscente al encontrarse próximas y efectuar la transferencias de energía entre ellas. Durante el desarrollo del AlphaLisa, las beads conjugadas a los reactivos implicados en un inmunoensayo se aproximan al ocurrir el reconocimieno del analito permitiendo la transferencia de energía y consecuente generación de señal, la cual será proporcional a la cantidad de analito en muestra. En este trabajo, empleando la tecnología AlphaLisa desarrollamos un inmunoensayo homogéneo y no competitivo, para la detección de atrazina empleando un anticuerpo monoclonal antiatrazina y los Nanopeptámeros. El ensayo, que denominamos NanoAlphaLisa, permitió la detección homogénea de 0,3 ng/mL de atrazina en muestras de agua luego de sólo una hora de incubación. Dado que los límites aceptados de atrazina en agua potable son de 2 ng/mL, este ensayo puede ser una herramienta válida para el monitoreo de atrazina en aguas, aprovechando las ventajas de la automatización y el análisis de alto rendimiento que proporciona la tecnología AlphaLisa.                                                           

Contacto: glassabe19@gmail.com
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Resumen:
La transglutaminasa tisular (TG2) es una proteína multifuncional que participa en diferentes procesos celulares. Además está implicada en la patogenia de la enfermedad celíaca (EC) y otras patologías con componente inflamatorio. La TG2 tiene dos actividades principales: aciltransferasa (TGasa) y unión/degradación de GTP (GTPasa) que están mutuamente reguladas. Se ha reportado la expresión de variantes de splicing alternativo (v2, v3, v4a y v4b) que son versiones truncadas de la TG2 canónica (v1) en su región C-terminal y contribuyen a la diversidad funcional de esta enzima. Se analizó por qPCR la expresión de las variantes de TG2 en leucocitos humanos obtenidos de sangre periférica de individuos sanos y de pacientes celíacos. Los resultados muestran que se expresan todas las variantes con predominio de TG2v1 y TG2v2; este perfil también se observa en las fracciones de neutrófilos y linfocitos de ambos grupos. Al comparar la expresión de las variantes entre estos grupos de estudio, se observaron niveles significativamente superiores de TG2v1 en los pacientes e interesantemente también de TG2v3 (p=0.005 y p=0.009 respectivamente). Estas diferencias son independientes de la condición clínica de los pacientes (enfermedad activa versus remisión por dieta libre de gluten). En cambio, la mayor expresión de IL1 e IL6 en los leucocitos de pacientes en relación a los controles, parece reflejar el estado inflamatorio asociado a la EC. Los resultados sugieren que la regulación de la TG2 mediante el aumento relativo de la expresión de TG2v3 (que carece del dominio de unión a GTP y cuya actividad TGasa estaría desregulada) podría contribuir a la patogenia de la EC. Nuestro trabajo en marcha está orientado a descifrar los cambios inducidos en la función celular como consecuencia de la expresión diferencial de las variantes de TG2 en tejidos extraintestinales frecuentemente afectados por la EC.

Contacto: parbildi@higiene.edu.uy
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Resumen:
La larva del parásito  Echinococcus granulosus induce respuestas reguladoras. Nuestro grupo describió en este parásito una familia de proteínas Kunitz (EgKU) potencialmente secretadas, candidatas a contribuir a dicha regulación. EgKU1 y EgKU4, bloquean canales de potasio activados por voltaje (K_v), y con mayor afinidad, canales de sodio activados por pH ácido (ASICs). EgKU3, es un inhibidor de alta afinidad de quimotripsina, que bloquea solo marginalmente ASICs, y  en este trabajo incluimos como control. Los K_v regulan la activación convencional de células dendríticas y macrófagos en respuesta a agonistas de TLR, y el eflujo de potasio, a través de canales no identificados, es necesario para la activación del inflamasoma NLRP3. Por otra parte se ha demostrado recientemente que la acidosis extracelular, que en condiciones fisiopatológicas se genera en áreas inflamadas, activa  células dendríticas. Se propone que en esta activación participan los ASICs. Nuestro proyecto abarca el estudio de los efectos mediados por la actividad bloqueante de canales de EgKU1 y EgKU4  sobre la activación convencional, activación del inflamasoma NLRP3 y activación producida por acidosis extracelular en células dendríticas de ratón derivadas de médula ósea en presencia de GMCSF. En cuanto a activación convencional con un agonista de TLR (LPS) no se observaron efectos significativos. Para la activación del inflamasoma NLRP3 se observó inhibición marginal, poco reproducible, y presente en las tres proteínas Kunitz, lo que sugiere que los efectos no se deben al bloqueo de canales. En cuanto a la activación por acidosis, hasta el momento se reprodujeron los resultados publicados que informaban que  al exponer a las células a una disminución en el pH extracelular, se genera un aumento en la expresión de MHCII, y en menor grado de otras moléculas de superficie. Actualmente estamos evaluando posibles efectos inhibitorios de EgKU1 y EgKU4 sobre esta la activación por acidosis.

Contacto: csagasti@higiene.edu.uy
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Resumen:
En los Bancos de Leche Humana (BLH), la leche donada es sometida a la pasteurización de Holder (62.5°C/30minutos) para eliminar gérmenes patógenos.  Sin embargo, este procedimiento tiene efectos adversos sobre los componentes inmunológicos. Con el fin de optimizar la calidad de la leche, nos propusimos evaluar los efectos de dos métodos innovadores de pasteurización (Altas Presiones Hidrostáticas, APH; Ultra-Altas Presiones Hidrostáticas, UAPH), sobre los anticuerpos como principales componentes inmunológicos. Se procesaron en forma aséptica las muestras correspondientes a pooles de leche extraída por 5 donantes entre los días 13 y 90 post-parto.  Cada muestra fue pasteurizada por los tres métodos y al igual que la leche cruda, fueron conservadas a -80ºC hasta el análisis inmunoquímico. Se analizaron varias condiciones de temperatura y presión para cada método: 10-30ºC a 250-600MP para APH y 20°C a 200-300MPa para UAPH para establecer las condiciones óptimas. Los principales resultados obtenidos hasta el momento sugieren que los métodos de APH y UAPH presentan una mayor retención de anticuerpos respecto al método tradicional. Mediante la pasteurización de Holder, la IgA remanente fue del 64%, mientras que con los métodos alternativos se incremento a 99% en las condiciones óptimas (APH:20ºC/350MPa; UAPH:20°C/200MPa). En relación a IgM, con Holder se detectó un nivel de retención del 21%, mientras que con APH sorprendentemente se alcanzó una retención total (100%) en algunas muestras (20°C/350MPa), y del 85% con UAPH (20°C/200MPa).  Los procesos fueron validados con los controles microbiológicos que se realizan rutinariamente en los BLH. Los resultados observados permiten visualizar a ambos métodos, tanto APH como UAPH, como una alternativa posible para optimizar la calidad inmunológica de la leche procesada en BLH para su administración a niños prematuros.

Contacto: crodriguez@fq.edu.uy
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Resumen:
Los anticuerpos de cadenas pesadas (HCAbs), presentes en Camélidos, presentan un sitio de unión a antígeno que consiste en sólo 16 KDa y es denominado nanobody.  Como resultado de las características sobresalientes que presentan dichos anticuerpos, como por ejemplo altos rendimientos de expresión soluble en E. Coli, termoestabilidad y alta estabilidad fisicoquímica, han sido ampliamente utilizados como herramientas biotecnológicas. Debido a la importancia en generar herramientas de monitoreo para pequeñas moléculas tales como drogas, toxinas, pesticidas, a las que globalmente denominamos haptenos, la generación de nanobodies en esta línea es de gran interés. Actualmente, se han reportado varios ejemplos de nanobodies contra haptenos, si bien no siempre son interacciones de muy alta afinidad, hay ejemplos en donde reconocen a su analito con afinidades de orden nanomolar. Inicialmente se dudaba que el sitio de unión formado únicamente por 3 CDRs presente en los HCAbs fuera capaz de generar una hendidura hidrofóbica para acomodar al hapteno como sí sucede en los anticuerpos convencionales, donde el sitio de unión lo conforman 6 CDRs provenientes de las cadenas livianas y pesadas. Sin embargo, los nanobodies demostraron ser capaces de adoptar diferentes conformaciones con el fin de interactuar con pequeñas moléculas. En este trabajo, se resolvió la estructura cristalográfica de 2 nanobodies libres y en complejo con su antígeno, el antimicrobiano TCC. La forma de reconocimiento de dichos complejos mostró una interacción muy peculiar, descripta previamente como “Tunnel-like binding”, donde el sitio de unión a antígeno es un túnel formado principalmente por el CDR1 y una región en el FR3, denominada CDR4. Los residuos que presentan mayor participación en el reconocimiento del TCC visualizados en la estructura, resultaron ser fundamentales para la interacción nanobody-hapteno ya que la generación de mutantes en dichos residuos disminuyó drásticamente la afinidad de los anticuerpos por su antígeno.

Contacto: stabaresdarosa@fq.edu.uy
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Resumen:
Los avances en la ingeniería tisular y la medicina regenerativa  han desarrollado  estructuras que posibilitan la reparación y restauración fisiológica de tejidos. Para ello, se utilizan andamios biocompatibles y biodegradables en conjunción con determinadas células para generar productos que simulan estructural y funcionalmente el tejido diana. Las matrices biopoliméricas de colágeno constituyen biomateriales que pretenden imitar la matriz extracelular nativa, actuando como un andamiaje temporario que permite la proliferación organizada de las células. Entre las células utilizadas para regeneración tisular, las células estromales mesenquimales (MSC) son una de las fuentes más utilizadas en la actualidad por sus propiedades biológicas particulares. En este contexto, el objetivo general del presente trabajo fue evaluar la citotoxicidad y adherencia celular de matrices desarrolladas a partir de colágeno tipo I bovino, además de su rol como andamio para la diferenciación de las MSC de médula ósea a linajes osteogénico y adipogénico.  La citotoxicidad se evaluó mediante el eensayo de MTT, mediante la exposición de distintas líneas celulares a un extracto de la matriz colagénica. La adherencia celular a la matriz colagénica se determinó mediante el ensayo live/dead marcando con FDA/IP las líneas celulares BJ, MS5 y NIH-3T3. Asimismo, se evaluó la capacidad de diferenciación sobre la matriz de una línea primaria de células estromales mesenquimales (MSC) de médula ósea.  Las MSC fueron diferenciadas a los  linajes osteogénico o adipogénico luego de ser sembradas sobre la matriz colagénica y expuestas a los respectivos medios inductores de diferenciación durante 15 días. A continuación, las células fueron fijadas y teñidas para evidenciar la diferenciación al linaje correspondiente. El extracto de matriz no resultó citotóxico para las líneas celulares evaluadas. Dichas células lograron adherirse correctamente a la matriz colagénica. Se evidenció cualitativamente la diferenciación de las MSC de médula ósea a los linajes osteogénico y adipogénico.

Contacto: lucianapereira@fq.edu.uy
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Resumen:
El cáncer de mama es una enfermedad con alta incidencia y mortalidad a nivel mundial. Esto hace necesaria la investigación dirigida al desarrollo de estrategias terapéuticas nuevas o complementarias. La carcinogénesis mamaria inducida en ratas con N-nitrosometilurea (NMU) presenta características similares a tumores mamarios humanos, siendo un modelo pre-clínico de gran valor para evaluar el efecto de nuevas terapias contra el cáncer de mama. Al tratarse de tumores heterogéneos, resulta relevante correlacionarlos con los parámetros clásicos de diagnostico del cáncer de mama empleados en humanos, a fin de poder asociar el efecto de una terapia experimental con el tipo de tumor tratado. Por eso, en primer lugar decidimos clasificar un amplio número de tumores inducidos con NMU en ratas Wistar para luego evaluar el efecto de una terapia génica basada en la expresión intratumoral de interleuquina-12 (IL-12). Tras la administración de NMU se cuantificó un promedio de 4±2 tumores/rata en el período de estudio. La zona de aparición más frecuente fue la costal superior y los tumores se clasificaron en su mayoría como adenocarcinoma quístico papilar infiltrante, adenocarcinoma quístico papilar con áreas ductales infiltrantes y carcinoma lobulillar infiltrante. Por inmunohistoquímica se comprobó que todos los tumores fueron hormono-dependientes (ER+ y PR+), siendo la mayoría de éstos de grado 3 y negativos para HER-2. El tratamiento de tumores clasificados como adenocarcinoma quístico papilar infiltrante con 2 dosis de un vector alfaviral que expresa IL-12 consiguió inhibir el crecimiento tumoral de forma significativa. La valoración inmunológica de la respuesta se correlacionó con un mayor infiltrado linfocitario y expresión de interferón gamma. Además, en el tejido tratado se observó re-absorción del epitelio anaplásico y presencia de glándulas secretorias sin diferenciación maligna. Estos datos indican que la terapia génica con IL-12 podría ser beneficiosa para complementar los tratamientos pre-operatorios actuales de tumores mamarios hormono-dependientes.

Contacto: nmazza@higiene.edu.uy
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Resumen:
La terapia génica consiste en la transferencia de material genético (fundamentalmente genes que codifican proteínas) a células somáticas del organismo con el fin de obtener un beneficio terapéutico. Esta terapia tiene una clara aplicación para el tratamiento de enfermedades monogénicas crónicas, tales como la fibrosis quística o las inmunodeficiencias severas hereditarias. Sin embargo, además de la complementación génica, las estrategias de terapia génica comprenden la regulación o edición de genes celulares alterados, la inhibición de la síntesis de proteínas deletéreas, la producción ectópica de proteínas terapéuticas y la inducción de muerte de células tumorales directa o indirectamente mediada por la activación de pro-drogas o del sistema inmune. Anualmente se publican cientos de trabajos sobre tratamientos experimentales de terapia génica evaluados en modelos animales, habiéndose realizado hasta la fecha más de 2000 ensayos clínicos en todo el mundo, de los cuales más del 60% se han dirigido al tratamiento del cáncer. De hecho, ya se han licenciado tres productos de terapia génica in vivo para el tratamiento del cáncer (Gendicine, Oncorine y Talimogene laherparepvec), que, junto a las prometedoras estrategias de terapia génica ex vivo que involucran la modificación de células inmunes del organismo con genes quiméricos (ej: CAR-T), sugieren que a medio plazo se pueda contar con nuevos productos de uso clínico. En esta presentación se comentarán los avances de este sector de la biomedicina, los desafíos por resolver y los resultados que hemos obtenido en estudios pre-clínicos de terapia génica in vivo del cáncer de mama.

Contacto: mgkramer@higiene.edu.uy
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Resumen:
Nuestro grupo se ha centrado en el desarrollo de vectores adecuados para el tratamiento de lesiones agudas del sistema nervioso, tales como el trauma cerebral. En el presente trabajo utilizamos nano-vectores modulares recombinantes y vectores lentivirales no integrativos (IDLV). Nuestros resultados muestran que ambos tipos de vectores median la sobre-expresión de un transgén reportero (GFP) rápidamente (24hs) luego del trauma. Si bien se observan diferencias en los niveles de expresión y patrón temporal, en ningún caso resultaron tóxicos o pro-inflamatorios luego de la lesión. En base a estos resultados y resultados previos mostrando la que la sobre-expresión del immunoreceptor CD300f resultaba en una reducción del volumen de lesión cerebral luego de un daño excitotóxico, diseñamos un protocolo de terapia génica adecuado para el trauma cerebral. A las 4 horas luego de la lesión inyectamos los distintos vectores sobre-expresando GFP o CD300f bajo el promotor de CMV. Se siguieron los animales durante 3 meses mediante diferentes pruebas neurológicas y se analizó el porcentaje de tejido cerebral remanente. Todos los vectores mostraron un excelente perfil terapéutico: los animales tratados con ambos vectores control presentan un mejor desempeño en los test neurológicos y un mayor porcentaje de tejido cerebral conservado comparado con los animales inyectados con vehículo. Sin embargo, si bien la sobre-expresión de CD300f mediada por NLSCt resultó neuroprotectora a los 3 días, este efecto se revierte a los 3 meses, tanto con el vector NLSCt como con el HNRK o IDLV. En conclusión, nuestros resultados refuerzan la hipótesis de que tanto los nano-vectores modulares recombinantes como los lentivectores son herramientas terapéuticas adecuadas para tratar lesiones traumáticas del sistema nervioso. Sin embargo, la sobre-expresión general del gen diana CD300f no resulta adecuada para el tratamiento del trauma cerebral, planteando la hipótesis de que una expresión específica en microglía/macrófagos podría mostrar efectos neuroprotectores.  

Contacto: LNegro@pasteur.edu.uy
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Resumen:
En 2007 el Área de Inmunología-F. Veterinaria-UdelaR, comenzó a incursionar en Medicina Regenerativa Veterinaria (MVR). En 2010 se creó el 1^er Grupo Multidisciplinario CSIC 881142 de MVR, que es Internacional con investigadores de la Región y Europa. Las Terapias Regenerativas, son procedimientos que “Regeneran” el tejido dañado, y no solo “reparan”, como apuntan los tratamientos convencionales. Las Células Madre Mesenquimales (CMM) o Mesenchymal Stem Cells (MSC) tienen 5 características atractivas para su aplicación in vivo: Multipotencialidad, Inmunomodulación, Angiogénesis, migran al foco inflamatorio (homing), poder Antimicrobiano. La gran mayoría de las propiedades atribuidas a las CMM se deben a los factores que ellas secretan. Además de las CMM, también son elementos de MR, el Plasma Rico en Plaquetas (PRP) y Parches de Fibrina, por los factores de crecimiento que liberan las plaquetas una vez activadas. Las líneas de investigación de MRV en el Área de Inmunología son: Aplicación de Terapia Regenerativa en casos clínicos y Modelos. Con la aplicación de la MR hemos podido contribuir a resolver casos clínicos que no tuvieron éxito con el tratamiento tradicional en Uruguay. Nuestro propósito es continuar contribuyendo al conocimiento de los componentes de la MRV aplicados. También difundir los resultados, para que los médicos y veterinarios clínicos puedan considerar la aplicación de la Medicina Regenerativa.

Contacto: jacmaiso@gmail.com
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Resumen:
Las células madre mesenquimales (CMM) presentan gran interés en veterinaria por su potencial uso en medicina regenerativa. Los caninos, equinos y felinos tienen un rol protagónico como animales de compañía y atletas. Además, son valiosos modelos experimentales para humanos, debido a las similares características anatomofisiológicas, vida longeva y pueden ser sometidos a períodos prolongados de rehabilitación. Tradicionalmente para la proliferación de las CMM se suplementa con suero fetal bovino (SFB), que tiene varios inconvenientes, como el hecho de trasplantar proteínas xenogénicas y afectar el bienestar animal durante su extracción. Existe escasa información sobre las características de las CMM en especies domésticas y potenciales suplementos de cultivo. El objetivo fue difundir los principales avances en caracterización de las CMM provenientes de las especies canina, equina y felina, además de la evaluación del lisado plaquetario alogénico como potencial reemplazo del SFB. Para ello, fueron aisladas células de la fracción vascular estromal de tejido adiposo de las 3 especies. Fueron evaluadas diferentes características: 1) capacidad proliferativa; 2) su inmunofenotipo y 3) la multipotencialidad. Las células caninas y equinas han sido caracterizadas y se ha conseguido evaluar el reemplazo del SFB en las equinas observándose características similares. En felinos se ha comenzado con el aislamiento celular. En conclusión, se continúa con la caracterización de las poblaciones celulares de caninos, equinos y felinos con diferentes grados de avance, con especial énfasis en características de atractivo terapéutico. Por último, se viene generando un banco de CMM de origen animal con el propósito de futuros estudios in vitro, como también poder ser utilizadas para la aplicación terapéutica.

Contacto: ykevin05@gmail.com
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Resumen:
En los últimos años se han publicado investigaciones que demuestran que la administración de células estromales de medula ósea (CEM) promueve la recuperación renal. Objetivos: Evaluar el efecto de CEM en atenuar el daño parenquimatoso en 2 biomodelos experimentales de nefropatía. Métodos: En ratas Wistar hembras se realizaron: A. Nefrectomía 5/6 (NFX), control a 10 semanas y B. Ligadura ureteral unilateral (UOU), control a 2 semanas, subdivididos en 1. Controles y 2. Tratados con CEM y los grupos sham correspondientes. Al finalizar el seguimiento, se extrae sangre de aorta (para azoemia, creatininemia, ionograma), corazón (para evaluar fibrosis y espesor miocárdico) y riñones para scores histológicos e inmunohistoquímica para evaluar transición epitelio-mesenquimal e injuria nitro-oxidativa. Resultados.  El grupo NFX 5/6 vs sham presentó creatininemia 0,66±0,23 vs 0,27±0,01 mg/dl (p< 0.05), azoemia: 56,5±13,3 vs 29±4,79 mg/dl (p <0.05) y score de daño tubulointersticial 0,94±0,24 vs 0,19± 0,17 (p<0.01). El modelo UOU presentó aumento de creatininemia vs sham (0,59±0,06 vs 0,29±0,03 mg/dl) y de azoemia (41,2±3,11 vs 29±4,8 mg/dl) (p< 0.0001). Se obtuvieron CEM de ratas Wistar macho que se administraron, sin incidentes, por vía venosa periférica en el grupo NFX y por vena cava en UOU, a dosis de 1x10⁶ células, en pasaje P2 a P6, por rata (3 UOU y 2 NFX). El grupo UOU+CEM mostró un descenso de creatininemia vs UOU (0,44±0,07 vs 0,60±0,06 mg/dl) y de azoemia (34,33±5,51 vs 41,80±3,11 mg/dl) (p<0.05). Conclusiones. Los biomodelos tuvieron el desempeño esperado y los resultados preliminares del modelo UOU mostraron beneficios con la administración de CEM.  

Contacto: carina491986@gmail.com
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