Resumen:
Las rocas representan el principal refugio para la vida en algunos de los ambientes más extremos del planeta, como el antártico. Las comunidades microbianas que habitan el interior de las rocas se conocen como endolíticas. Estos microorganismos son capaces de colonizar grietas, poros y fisuras de las rocas así como modificarlas, directa o indirectamente, mediante procesos físicos y químicos. A escala global, estas interacciones afectan los ciclos de los elementos de la biósfera. Nuestro trabajo tiene como objetivo caracterizar la diversidad funcional de bacterias endolíticas antárticas, en concreto, en cuanto a los sistemas involucrados en la homeostasis de metales. Por otro lado, determinar la capacidad de las bacterias para producir pigmentos y evaluar si su síntesis está relacionada a la tolerancia a metales, como otro factor de protección frente a las condiciones del ambiente. Al momento hemos aislado e identificado 76 bacterias cultivables provenientes de dos muestras de rocas antárticas, identificadas como andesitas basálticas. Como se esperaba, el número de unidades formadoras de colonia fue de varios órdenes de magnitud menor que los obtenidos en otro tipo de muestras ambientales del lugar. Se encontraron representantes de Alpha, Beta y Gammaproteobacteria, Actinobacteria, Bacteroidetes, Cyanobacteria y Deinococcus-Thermus, de 22 géneros distintos. Asimismo, muchos aislamientos mostraron una baja identidad de secuencia con respecto a aquellas disponibles en las bases de datos públicas, lo que puede estar indicando la novedad de los microrganismos que colonizan este nicho. Además, detectamos aislamientos resistentes a Cu(II) 1mM, Mn(II) 3mM, algunos a Ni(II) y Zn(II) 1mM, Ag(I) 50μM y Co(II) 200μM, e incluso, los niveles de tolerancia de las bacterias se relacionaron con las abundancias de los distintos metales en las muestras de roca. Interesantemente, la mayoría de los aislamientos fueron pigmentados y casi todos estos pigmentos fueron identificados como carotenoides.

Contacto: v.carrasco02@gmail.com
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Resumen:
Las infecciones del tracto urinario (ITU) se encuentran entre las infecciones más comunes que afectan al ser humano. Entre los principales agentes etiológicos se encuentra Proteus mirabilis. Este patógeno está implicado en ITU complicadas, principalmente asociadas a la cateterización. P. mirabilis tiene la capacidad de formar biofilms, particularmente sobre superficies abióticas como catéteres. Diversos factores de virulencia están relacionados con la capacidad de formar biofilm incluyendo factores de adhesión, captación de hierro y movilidad, entre otros. El objetivo del trabajo fue evaluar el papel que cumplen genes relacionados con la virulencia y formación de biofilms en la capacidad de P. mirabilis de invadir células uroepitaliales y formar comunidades bacterianas intracelulares (CBI) como las descritas en Escherichia coli uropatogénica. Mutantes de una cepa patógena de P. mirabilis de origen clínico que exhibieron una capacidad alterada para formar biofilms fueron seleccionadas para su evaluación. Estas son defectivas para genes relacionados con adhesión (proteína fimbrial SteB y subunidad fimbrial mayor de la fimbria UCA),  sistemas de captación de hierro (ferritina y receptor Ton-B dependiente) y sistemas transportadores (PitA). Empleando células de vejiga humana T24, se realizaron ensayos de invasión con una MOI de 5 bacterias/célula, comparando con la cepa salvaje 2921. La cuantificación se realizó por recuento en placa. Aunque se observaron algunas diferencias en la capacidad de invasión celular de las mutantes con respecto a la cepa salvaje, estas no fueron significativas. Por otra parte, las mutantes fueron menos citotóxicas que la cepa salvaje presentando un mayor porcentaje de supervivencia celular. A partir de estos resultados se puede sugerir que los factores bacterianos implicados en la formación de biofilm de P. mirabilis no se relacionan con la invasividad celular y que existen otros mecanismos implicados en la misma.

Contacto: mgonzalez.iibce@gmail.com
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Resumen:
Las purinas son compuestos nitrogenados esenciales para la célula, componen ácidos nucleicos, algunos aminoácidos  y coenzimas, participan en el metabolismo energético (ATP, GTP) y son fuente de nitrógeno para muchos organismos. El transporte de purinas es mediado por transportadores sustrato-específicos. Todos los transportadores conocidos, desde bacterias a mamíferos y plantas, pertenecen a tres familias conservadas (NCS1, NAT/NCS2 y AzgA-like). El basidiomycota Phanerochaete chrysosporium tiene dos transportadores de purinas: PhU (NAT) y PhZ (AzgA-like). phU se regula transcripcionalmente como los homólogos caracterizados: se induce por sustratos y cuando estos son fuente de nitrógeno se induce además por carencia de nitrógeno y se reprime por amonio. En el caso de phZ a pesar de que sus sustratos son fuente de nitrógeno, la regulación del transportador parece estar ligada al anabolismo: es inducido por sustrato pero no por carencia y no es reprimido por amonio. Estas y otras diferencias lo hacen un candidato interesante para la caracterización funcional y estructural.   Las proteínas silvestres y mutantes expresadas en un mismo contexto genético, Aspergillus nidulans carece de transportadores propios fueron analizados: ubicación subcelular (fusión a GFP), crecimiento y transporte (uptakes competitivos con [³H]-hipoxantina). Los residuos a mutagenizar se seleccionaron mediante análisis comparativo de secuencias y modelado estructural por homología. PhZ transporta hipoxantina (Ki 0,2 μM); adenina, guanina y 8-azaguanina (80-90% de inhibición) y además es capaz de transportar xantina con equivalente porcentaje de inhibición. Mutantes de PhZ (L124M, T429P y A148) mostraron mayor resistencia al tóxico 8-azaguanina y otros (T131A) diferencias de localización subcelular. Concluimos que: PhZ es capaz de transportar xantina, diferenciándose funcionalmente de otras proteínas AzgA-like. L124, T429 y A148 interaccionan con el sustrato y T131 tendría una función relacionada a la regulación post-traduccional. PhU transporta los mismos sustratos que otros miembros NAT y determinamos que P456 es clave para su estructura.

Contacto: juli.dourron@gmail.com
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Resumen:
Varios estudios recientes reportan una red de comunicación bidireccional entre la microbiota del intestino (MI) y el sistema nervioso central. La MI en el adulto humano consiste mayoritariamente en bacterias y disrupciones en la homeostasis de la MI (disbiosis) han sido asociadas con diversas patologías y trastornos emocionales. Varios estudios han mostrado que la modificación de la MI por antibióticosen ratones provoca la aparición de comportamientos anormales en modelos animales de depresión y ansiedad. Sin embargo, un número limitado de estudios han examinado la relación microbiota-adicción. El objetivo de este trabajo fue comenzar a estudiar los efectos inducidos por el consumo de drogas de abuso, tales como la cocaína, en la estructura de la comunidad de la MI utilizando modelos animales que permiten fijar variables como dieta, tipo de droga y tiempo de consumo. Un grupo de ratas macho fue tratado durante 14 días con cocaína base (25 mg) volatilizada y administrada por inhalación pulmonar. Evidencias previas del laboratorio indican que cocaína base se vende adulterada con fenacetina y cafeína. Así, otro grupo de animales fue tratado con cocaína + fenacetina (25 mg) y cocaína + cafeína (25 mg) y con la combinación de los tres compuestos. Grupos control y tratados con fenacetina y cafeína volatilizadas fueron también incluidos. La materia fecal de los animales fue recogida luego de terminado el tratamiento y procesada para la extracción de ADN bacteriano. Análisis de fingerprinting basados en el espaciador intergénico del operón ribosomal (ITS) mostraron que los tratamientos indujeron cambios en la estructura comunitaria de la MI en relación a la estructura del grupo control, siendo éstos más evidentes con fenacetina. Aunque son necesarios más estudios para identificar las especies bacterianas afectadas, estos datos muestran un gran potencial para futuros estudios traslacionales en esta área emergente de la comunicación MI-cerebro.

Contacto: cpiccini@iibce.edu.uy
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Resumen:
Las infecciones causadas por Escherichia coli son uno de los mayores problemas sanitarios y económicos de los productores ganaderos mundialmente. Los patotipos E. coli enterotoxigénica y enteropatógenica se asocian a diarrea neonatal en terneros, mientras que E. coli enterohemorrágica y productora de toxina Shiga son importantes patógenos zoonóticos, siendo los bovinos su principal reservorio. La terapia antimicrobiana se utilizada para tratar enfermedades infecciosas. Lamentablemente, su uso indiscriminado se ha acompañado de un incremento en las resistencias, acarreando complicaciones en los tratamientos. Los antibióticos más comúnmente utilizados en animales son además ampliamente utilizados en la clínica humana y la transferencia de genes de resistencia a betalactámicos y fluoroquinolonas (FQ), debida a contaminación cruzada, es un problema cada vez más frecuente. Además, la creciente resistencia transferible a colistina ha emergido como una gran amenaza para la salud, ya que se utiliza en bovinos pero es de último recurso en infecciones multirresistentes en humanos. El objetivo de este trabajo consistió en evaluar los mecanismos de resistencia a antibióticos de E. coli de origen bovino y su papel como diseminadores de resistencia. El 36% de los aislamientos fueron resistentes a FQ y se constató la ocurrencia de multirresistencia. Se detectó la presencia de genes de resistencia a quinolonas qnrB2like y qnrS1 y se determinó resistencia a betalactámicos por betalactamsas de espectro extendido grupo CTXM14 y betalactamasas tipo AmpC. Por otro lado, se encontró el Integrón1 con arreglos que confieren resistencia a aminoglucósidos y trimetoprim. Finalmente, no se detectó la presencia del gen de colistina mcr1. La resistencia a antibióticos es un problema en la ganadería en Uruguay. E. coli de origen bovino puede jugar un papel importante en enfermedades en humanos, favoreciendo la trasferencia de resistencias inter-especies y obstaculizando los tratamientos. En este sentido, urge la implementación de la vigilancia en ambos ámbitos.

Contacto: aumpierrez@iibce.edu.uy
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Resumen:
La presencia de múltiples determinantes de resistencia a antibióticos en bacterias patógenas humanas es reconocida como una de las amenazas mas significativas a la salud pública. Aunque en ambientes naturales el rol principal de los antibióticos es el de servir como transductores en la comunicación e interacción entre microorganismos, la presión impuesta por su uso irracional, sea en el contexto clínico como productivo (a través de su empleo con fines profilácticos o como promotores del crecimiento animal), ha facilitado y promovido la selección, evolución, dispersión y proliferación de genes determinantes de resistencia a los mismos. Su dispersión y proliferación son además favorecidas por su localización en elementos mobilizables horizontalmente como ser plásmidos, transposones y sistemas de integrones. Estos últimos, estructuras modulares con el potencial de contener simultaneamente determinantes de resistencia a múltiples antimicrobianos. En este trabajo se analizaron aguas residuales domésticas y aguas residuales de un tambo experimental con el objetivo inicial de relevar la presencia de sistemas de integrones así como de determinantes genéticos de resistencia a antimicrobianos. Los resultados del mismo revelan la presencia en ambas matrices de integrasas de tipo 1 y 2 así como de integrones de clase 1 y 2. Asimismo, ensayos de PCR dirigidos a determinar la presencia de genes de resistencia a aminoglicósidos (aac, aph), β-lactámicos (bla_{CTX-KPC- OXA-TEM-VIM}), cloramfenicol (catA), trimetoprim (dhfrXII), macrólidos (ermF), streptotricina (sat), tetraciclina (tetL-M), vancomicina (vanA) así como a aminas cuaternarias (qacE-G) y mercurio (merA), en este caso por su potencial asociación a integrones clase 1, mostraron en ambas matrices con perfiles diferentes, productos de amplificación con los tamaños correspondientes esperados. Estos resultados preliminares remarcan la importancia del relevamiento ambiental de determinantes de resistencia a antimicrobianos así como la necesidad del aislamiento y la caracterización fenotípica y genómica de microorganismos portadores de integrones.

Contacto: Evehaller@gmail.com
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Resumen:
  Las enfermedades trasmitidas por alimentos (ETAs) constituyen un grupo heterogéneo de patologías asociadas al consumo de agua o alimentos que contienen una gran variedad de agentes infecciosos o no infecciosos nocivos para la salud de los seres humanos. La mayoría de los países que cuentan con sistemas para la vigilancia y notificación de estos casos han documentado durante las últimas décadas aumentos significativos en la incidencia de enfermedades causadas por microorganismos trasmitidos por los alimentos, incluyendo Salmonella spp., Campylobacter jejuni, Listeria monocytogenes y diferentes patotipos/virotipos de E. coli diarreogénicos (ECD). Hasta el momento se reconocen 6 virotipos clásicos en ECD: EPEC, ETEC, STEC, EIEC, EAEC, DAEC y aislamientos definidos híbridos, como la cepa O104:H4 responsable del brote de SUH en Alemania en 2004. Nuestro grupo de trabajo ha identificado la presencia de EPEC atípicos, STEC, EAEC y EIEC en casos de diarrea en niños y adolescentes. Muchos de estos agentes son trasmitidos por alimentos y se asocian a procesos severos como diarrea con sangre, colitis hemorragia y SUH. Hemos generado a lo largo de estos años datos sobre serogrupos, genotipos y perfiles de resistencia de diferentes ECD y estamos en condiciones de participar en trabajos de colaboración que traten de manera global el diagnóstico etiológico de los casos de ETA.    

Contacto: gvarela@higiene.edu.uy
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Resumen:
La listeriosis o enfermedad causada por Listeria monocytogenes, se sitúa entre las enfermedades transmitidas por alimentos de mayor relevancia para la salud pública y para la industria alimentaria, debido al impacto social y económico que tiene por la gravedad de su cuadro clínico. A pesar de los avances en su conocimiento, la listeriosis continúa siendo un problema importante por varios motivos. En primer lugar por su elevada letalidad, de hasta el 30% en los grupos de riesgo (neonatos, mujeres embarazadas, ancianos e inmunodeprimidos). En segundo lugar, porque L. monocytogenes presenta una serie de características que la convierten en un importante amenaza para las metas de inocuidad alimentaria: su ubicuidad en el medio ambiente hace que la diseminación a las instalaciones que elaboran alimentos sea frecuente y su gran capacidad de resistencia al frío, calor, acidez y salinidad favorecen su desarrollo durante el almacenamiento de los mismos. En tercer lugar, porque los grupos de riesgo constituidos por personas mayores e inmunocomprometidos están en continuo aumento. Por último, porque los brotes epidémicos de listeriosis son difíciles de investigar debido a que en general son pequeños, el periodo de incubación puede ser muy largo (hasta 70 días), y los pacientes se encuentran severamente enfermos o fallecidos lo que limita la posibilidad de obtener una historia alimentaria completa. ¿Que hemos hecho al respecto? Hemos estudiado unos 300 aislamientos de L. monocytogenes fundamentalmente de origen humano y alimentario realizando la  subtipificación molecular mediante determinación de serotipo y pulsotipo. Con ello hemos generado una base de datos importante que nos ha permitido conocer las cepas circulantes, colaborar con los organismos de control y con la industria en el estudio de brotes y en el control de esta bacteria en las plantas de procesamiento y en los establecimientos de venta de alimentos.

Contacto: imota@higiene.edu.uy
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Resumen:
La infección por el virus de la Hepatitis E (HEV) es una de las virosis emergentes que preocupa a la salud pública dada su compleja epidemiología. HEV se transmite principalmente por vía fecal-oral y presenta una mortalidad de hasta el 4 % en la población general y hasta el 20% en mujeres embarazadas. HEV se clasifica en 6 genotipos (G1-6), siendo los G1 y G2 antroponóticos, responsables de las epidemias en zonas endémicas. Los G3 y G4 se asocian a casos esporádicos en regiones no endémicas y países desarrollados y son considerados zoonóticos siendo los suidos los principales reservorios. En 2010 fueron reportados en Uruguay los primeros casos de infección por HEV en humanos, tratándose de casos autóctonos asociados al G3. Estas cepas resultaron estar filogenéticamente emparentadas con aislados suinos y humanos Europeos. Más recientemente se detectó el primer caso autóctono de infección por HEV humano G1 en Uruguay, filogenéticamente emparentado con cepas asiáticas. Este trabajo tiene como objetivo relevar a nivel molecular HEV en cerdos y jabalíes y para lo cual se investigó la presencia de HEV por PCR y Real Time PCR cuantitativa (RTqPCR) en un total de 140 animales. A su vez, se estudió la presencia de anticuerpos anti HEV en 380 muestras de suero de cerdos y jabalíes. En este trabajo se describe por primera vez un amplio relevamiento de HEV en suinos de Uruguay, y se reporta una alta seroprevalencia general de HEV. Se detectó una moderada frecuencia de infección en cerdos y jabalíes, con una notoria prevalencia del G3. Asimismo, por primera vez en América se identificó un aislado de HEV G1 epidémico en cerdos, considerado hasta el momento como exclusivamente antroponótico. Estos resultados sugieren que los cerdos y jabalíes son reservorios de HEV y como tales constituyen un riesgo de trasmisión zoonótica.

Contacto: smirazo@fcien.edu.uy
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Resumen:
Diversas formas infectantes de parásitos, como esporos, quistes, ooquistes, huevos o larvas, pueden encontrarse en los alimentos ya sea por contaminación de los mismos en cualquier etapa de su producción, recolección, conservación, preparación o consumo, o ya sea porque el alimento es parte en sí, del ciclo de transmisión del parásito, como ocurre con las carnes de diferentes orígenes. FAO/OMS establecieron en 2014 un ranking de parásitos trasmitidos por alimentos a nivel mundial de acuerdo a su impacto sobre la salud pública. De esos 24 agentes parasitarios hay 10 por lo menos que se diagnostican habitualmente en nuestro país. Sin embargo se desconoce su impacto real como enfermedades parasitarias transmitidas por alimentos debido a las numerosas dificultades para su control. Es necesario conocer bien aspectos íntimos de cada parásito, su ciclo y epidemiología para definir el riesgo asociado a su ingestión con alimentos, las formas de prevención y las estrategias de control. Es necesario desarrollar teconologías de diagnóstico de parásitos en alimentos. La notificación no es obligatoria para la mayoría de estas infecciones. Las migraciones, la expansión de hábitos alimentarios exóticos en cada región y las variaciones relacionadas con el cambio climático implican numerosos desafíos que habrá que enfrentar en los próximos años. Indudablemente la prevención, es decir las buenas prácticas asociadas al manejo integral de los alimentos, tanto a nivel familiar como industrial resultan fundamentales, y entre ellas destacamos la educación de la población sobre los riesgos y cómo prevenirlos.

Contacto: amacuna55@gmail.com
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Resumen:
Salmonella enterica es una de las principales causas de enfermedad transmitida por alimentos a nivel mundial, existiendo alrededor de 1500 serotipos diferentes. Estos serotipos se determinan en base a las distintas combinaciones de 46 antígenos O (somáticos) y 85 antígenos H (flagelares de primer y segunda fase). Clásicamente la tipificación de Salmonella se realiza mediante técnicas de aglutinación con anticuerpos, lo cual resulta caro y requiere una gran cantidad de tiempo y personal entrenado. Como alternativa se han propuesto métodos moleculares que, basándose en la secuencia de ADN, permiten una tipificación de Salmonella enterica comparable a la serotipificación. En este trabajo realizamos la tipificación de una colección de 58 cepas de Salmonella de origen humano y alimentario obtenidas en Bolivia entre 2008 y 2016, y comparamos los resultados obtenidos por el método clásico, por MLST usando el esquema de Achtman de 7 genes y por un método basado en 3 PCR múltiples que, mediante la amplificación de regiones variables de los genes wzx, fliC y fljB, permiten la determinación de 5 antígenos somáticos, 8 antígenos flagelares de primera fase y 7 de segunda fase, respectivamente. Los métodos de PCR permitieron la completa caracterización de 36 cepas de 9 serovares distintos. Al combinarlos con la secuenciación del gen FliC, se alcanzó la identificación de 15 serovares y un total de 54 cepas. Estos resultados fueron validados mediante técnicas serológicas y actualmente estamos realizando MLST a una selección de cepas para completar su caracterización. Con los métodos combinados se logró identificar 57 de 58 cepas: 55 corresponden a 16 serovares diferentes dentro de la subespecie enterica, y 2 a la subespecie diarizonae. Creemos que dichos métodos resultan actualmente más aplicables, sobre todo en laboratorios donde no existe la posibilidad de realizar serotipificación mediante métodos clásicos. Agradecimientos: Red CYTED-Salmoiber y CSIC  

Contacto: julietabisio@gmail.com
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Resumen:
El uso de microorganismos nativos con capacidad probiótica es una herramienta alternativa para el tratamiento y prevención de diversas patologías animales, como la diarrea neonatal de terneros (DNT). Los probióticos son seleccionados siguiendo una serie de criterios que permiten determinar in vitro e in vivo su potencial a partir de una colección de cepas. Las pruebas in vitro que se realizan incluyen evaluación de resistencia a condiciones similares a las encontradas en el tracto gastrointestinal, formación de biofilm, efecto antimicrobiano ante patógenos y adhesión a mucus y células epiteliales. El objetivo de este estudio fue evaluar la capacidad de colonización y persistencia en el tracto gastrointestinal de terneros de 4 cepas de Lactobacillus spp. nativas seleccionadas según su potencial in vitro. La evaluación de la persistencia implicó un ensayo in vivo de administración oral y cuantificación en heces por qPCR de las bacterias administradas, con primers dirigidos a cada especie. El estudio se realizó con 15 terneros (1 mes de vida), divididos en 5 grupos de 3 animales, de los cuales 4 grupos fueron de animales tratados con las 4 distintas cepas y el restante fue el grupo control, que recibió el vehículo sin bacterias. Se determinó que todas las cepas tuvieron una buena capacidad colonizadora, y particularmente la cepa L. reuteri 1.3B logró persistir en los 3 animales tratados hasta 5 días luego de finalizado el período de administración. Este resultado indica que las cepas fueron capaces de llegar de forma viable al intestino, siendo éste un requisito necesario para que puedan ejercer un efecto beneficioso en el hospedero.

Contacto: sofiafernandez03@gmail.com
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Resumen:
La Leucosis Bovina Enzoótica (LBE) es una enfermedad infecciosa de alta prevalencia en nuestro país que afecta principalmente al ganado lechero. Esta entidad se asocia a pérdidas económicas y un menor rendimiento productivo, existiendo una preocupación creciente sobre sus implicancias sanitarias. Es causada por un Deltarretrovirus denominado Virus de la Leucemia Bovina (VLB) que infecta principalmente linfocitos B. La LBE se caracteriza por presentar tres estadíos evolutivos: una primera fase de infección asintomática; una fase de linfocitosis persistente, y finalmente el desarrollo de una leucemia/linfoma a células B. La infección viral desencadena en el hospedero una respuesta inmune mantenida, caracterizada fundamentalmente por la presencia de anticuerpos específicos contra la glicoproteína viral de superficie gp51, tanto en suero como en leche. La seropositividad para estos anticuerpos es actualmente el método diagnóstico estándar. En el presente trabajo inicialmente se desarrolló y puso a punto un ELISA indirecto que detecta anticuerpos séricos anti-gp51, empleando una proteína recombinante producida en nuestro laboratorio. Su performance fue comparada con un ELISA comercial de referencia (VMRD Inc., WA). Fueron evaluados 1781 sueros bovinos provenientes de 7 tambos diferentes. En una segunda etapa se obtuvieron muestras pareadas de suero y leche de vacas en producción del tambo INIA-La Estanzuela en dos años consecutivos (231 y 248 muestras respectivamente). Estas fueron analizadas empleando nuestro test así como el kit VMRD. Los valores de especificidad y sensibilidad para nuestro ELISA en suero fueron de 0,96 y 0,94 respectivamente, mientras que para las muestras de leche los resultados mostraron una especificidad de 0,99 y una sensibilidad de 0.95. El test desarrollado en nuestro laboratorio mostró resultados comparables con el test de referencia, tanto empleando muestras de suero como de leche. Cabe destacar que el diagnóstico en muestras de leche respresenta una ventaja sanitaria, logistica y económica.

Contacto: andres.addiego@gmail.com
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Resumen:
La Leucosis Bovina Enzoótica (LBE) es una enfermedad causada por el Virus de la Leucemia Bovina (VLB) que afecta al ganado vacuno. En Uruguay se estima que más de un 50% del ganado lechero está infectado con VLB. La infección por VLB causa pérdidas en el sector productivo asociadas a: muerte por linfosarcoma, disminución de producción y calidad de la leche, incremento en intervalo interparto, mayor índice de refugos. Se han reportados varios trabajos intentando desarrollar inmunógenos que generen respuestas protectoras contra la infección por VLB, sin embargo, hasta el momento no existe en el mercado ninguna vacuna comercial que asegure una protección eficiente contra la infección por VLB.  El objetivo general de este trabajo es producir y caracterizar nuevos inmunógenos contra el VLB mediante la expresión de sus dos proteínas más inmunogénicas: Gag y Env, en un sistema de expresión eucariota. Por otra parte, nos interesa caracterizar la respuesta inmune humoral y celular frente a estos inmunógenos en un modelo murino.  Para ello proponemos producir “Virus Like Particles” (VLPs) que contengan la proteína Gag en su interior y la glicoproteína Env en la superficie de la partícula, las cuales presentarían y activarían al sistema inmune en condiciones similares a las existentes en los viriones infectantes, pero sin la capacidad infecciosa de estos. Por otro lado, introduciremos mutaciones aminoacídicas en el dominio de inmunosupresión de la glicoproteína Env, con el objetivo de estudiar su contribución en la modulación de la respuesta inmune antiviral. Al final de este proyecto esperamos contar con un conjunto de productos con capacidad de activar una respuesta inmune efectiva y mantenida contra el VLB con potencial aplicación para el diseño racional de vacunas eficaces, lo cual podría representar un aporte mayor en el desarrollo de programas de erradicación de esta enfermedad.

Contacto: nolivero@pasteur.edu.uy
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Resumen:
De las especies de hongos existentes en la tierra, se estima que muy pocas son conocidas actualmente y sólo un 5% han sido investigadas. Resulta interesante la bioprospección en ambientes poco explorados, con condiciones no tan favorables para la vida, donde puedan encontrarse cepas no identificadas que hayan desarrollado mecanismos adaptativos diferentes para superar las condiciones adversas. Debido a las condiciones extremas, los microorganismos del continente antártico y las islas vecinas han adquirido estrategias de adaptación únicas para poder sobrevivir. Aunque se han descrito nuevos grupos microbianos provenientes de la Antártida, las investigaciones realizadas con eucariotas, en particular con hongos son minoría, y son de utilidad tanto para estudios de biodiversidad así como de diversas aplicaciones. Comparado a los biomas templados, se conoce muy poco acerca de la diversidad fúngica de hongos de madera y la descomposición en ambientes polares. Algunos trabajos previos han demostrado que los hongos son importantes descomponedores a pesar de las condiciones ambientales extremas. Con el objetivo de avanzar en el conocimiento de la biología de hongos y ecología en la Antártida en el presente trabajo se realizó el aislamiento de hongos filamentosos a partir de muestras de madera colectadas en distintos puntos de la Isla Rey Jorge en la Antártida durante las campañas 2016 y 2017. Asimismo se realizó la identificación molecular de los aislamientos obtenidos mediante extracción de ADN, amplificación por PCR de la región ITS, secuenciación de dichos productos de amplificación y comparación con bases de datos. Dentro de la cepas estudiadas se identificaron algunas novedosas en este tipo de muestra y otras frecuentemente encontradas en muestras de madera provenientes de otras regiones de la Antártida, como las pertenecientes a la especie Pseudogymnoascus destructans.   Agradecimientos: Instituto Antártico Uruguayo, PEDECIBA QUÍMICA, ANII.

Contacto: felipeclavijo.94@gmail.com
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Resumen:
La salmonelosis es una de las causas más frecuentes de enfermedades transmitidas por alimentos en todo el mundo y los alimentos de origen animal son la fuente principal. Basándonos en los datos nacionales y en los existentes a nivel mundial obtenidos de revisiones bibliográficas nos propusimos el desarrollo de una cepa vacunal recombinante polivalente que posibilite la protección contra los 5 principales serotipos de Salmonella definidos a partir de este análisis (Enteritidis, Typhimurium, Newport, Infantis y Montevideo) por ser los de mayor prevalencia a nivel nacional y mundial. Para ello, proponemos utilizar una cepa viva atenuada del serovar Typhimurium (LVR01) y además seleccionar un conjunto de proteínas de superficie representativas de los serovares más prevalentes para ser expresados en la cepa vacunal. Con el fin de seleccionar los mejores candidatos para inducir una respuesta inmune, utilizamos un enfoque in silico.Seleccionamos, FlgK, IroE y RcsF como candidatos a ser incluidos en la vacuna ya que son proteínas que difieren respecto a su ortólogos en la cepa LVR01 pero muestran una alto porcentaje de identidad a nivel de aminoácidos entre serovares. Suponiendo que las proteínas de superficie comunes van a estar presentes en LVR01, la hipótesis es que estas 3 proteínas co-expresadas en la superficie de la vacuna podrían provocar una respuesta inmune protectora contra los 5 serovares.Ya hemos clonado estas proteínas fusionadas con el epítopo FLAG, en un plásmido bajo el control del promotor inducible en anaerobiosis, nirB. Hemos evaluado la expresión in vitro mediante Western Blot usando anticuerpos contra el epítopo FLAG y por real time PCR. El potencial de esta cepa recombinante de Salmonella para inducir una respuesta inmune  cruzada va a ser evaluado en un modelo murino. Esperamos obtener una cepa vacuna candidata para estudios adicionales en otras especies veterinarias.

Contacto: viperez@higiene.edu.uy
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Resumen:
  Los biofilms son comunidades microbianas, adheridas de forma irreversible a un sustrato y entre sí, inmersas en una matriz extracelular polimérica de producción propia. Proteus mirabilis es  una causa frecuente de infecciones del tracto urinario (ITU). Los biofilms favorecen la supervivencia de P. mirabilis en el tracto urinario brindando protección contra la acción del sistema inmunitario del hospedero y el efecto de antimicrobianos. El objetivo de este trabajo fue evaluar el papel de genes asociados a la formación de biofilms de P. mirabilis en la infectividad y en la formacion de biofilms. Para ello se emplearon 5 cepas mutantes en genes para ferritina,  un receptor Ton B-dependiente, una subunidad fimbrial mayor, la proteína fimbrial SteB y la proteína transportadora PitA, generadas por transposición a partir de una cepa salvaje de P. mirabilis. La infectividad se evaluó en el modelo de ITU ascendente en ratón y la bioarquitectura de los biofilms in vivo se determinó empleando el modelo de cámaras de difusión intraperitoneal en ratas. Las mutantes para ferritina y la proteína fimbrial SteB exhibieron una disminución significativa en la colonización del tracto urinario respecto a la cepa salvaje mientras que las otras cepas no presentaron diferencias significativas. La biomasa de los biofilms formados en  las cámaras intraperitoneales  por las cepas mutantes respecto a la salvaje fue baja y no presentó diferencias significativas al emplear la técnica semicuantitativa del Cristal Violeta. Por otro lado, los modelos 3D y los parámetros morfotopológicos generados por microscopía confocal mostraron que la cepa salvaje  forma biofilms maduros in vivo. En base a estos resultados se sugiere que los factores de P. mirabilis asociados a la formación de biofilms también pueden ser relevantes en el establecimiento de la ITU y que el ambiente y las superficies condicionan fuertemente la formacion de biofilms, en particular in vivo.

Contacto: anacaetano1017@gmail.com
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Resumen:
El interés en el estudio de bacterias promotoras del crecimiento vegetal (PCV), ha aumentado significativamente debido a su potencial uso como bioinoculantes con el fin de incrementar la productividad de cultivos de interés agronómico. Dentro de los mecanismos PCV se encuentran la capacidad de fijar biológicamente el N₂ atmosférico (diazotrofía), de solubilizar minerales (P,K), de producir fitohormonas y de controlar biológicamente fitopatógenos. Particularmente, las bacterias endófitas son aquellas capaces de colonizar los órganos internos de la planta sin causar infección aparente, siendo el modelo más estudiado Azoarcus sp. BH72. La misma está estrechamente relacionada con las cepas, Azoarcus indigens y Azoarcus communis, todas aisladas del pasto Kallar en Pakistán. Por otro lado, cepas del mismo género incluyendo Azoarcus sp. CIB y A. Olearius DQS-4T, han sido aisladas a partir de suelos o agua contaminada con compuestos aromáticos y poseen diferencias filogenéticas y metabólicas bien distintas a las asociadas a plantas. La cepa diazótrofa DQS-4T en particular, presenta características genéticas y fenotípicas muy similares a la cepa endófita BH72. En este contexto, el presente trabajo tiene como objetivo la caracterización bioquímica y molecular de las cepas del género Azoarcus: A. indigens, A. communis y Azoarcus sp. CIB y la evaluación de su actividad PCV. Para eso se evaluarán la presencia de mecanismos directos de PCV incluyendo la solubilización de P y K, la síntesis de Ácido Indol Acético (AIA) y la fijación biológica de N₂ atmosférico. Asimismo se evlauará la presencia de mecanismos posiblemente involucrados en la interacción con la planta incluyendo enzimas celulolíticas, proteasas y producción de biofilms. Adicionalmente se evaluará su efecto como inoculante mediante ensayos de PCV en plantas de sorgo dulce, caña de azúcar, arroz y festuca. Resultados de estas aproximaciones serán presentados.

Contacto: agustinbilat@gmail.com
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Resumen:
El  virus Orf (género Parapoxvirus, familia Poxviridae) es el responsable del Ectima Contagioso, una enfermedad zoonótica de gran importancia económica que afecta principalmente ovinos. Las reinfecciones con dicho virus son frecuentes y plantean la hipótesis de que la expresión de factores de virulencia que permiten evadir el sistema inmune tiene un rol esencial. Entre estos factores se encuentra la fosfatasa en tirosina del Virus Orf (OH1) capaz de afectar el estado de fosforilación del factor de transcripción STAT1 de la vía JAK/STAT, importante en la respuesta inmunitaria mediada por interferón. En este trabajo se buscó profundizar en el estudio del rol de OH1, buscando demostrar si OH1 interacciona directamente con STAT-1  in vitro y a nivel celular y  evaluando si esta interacción altera el nivel de fosforilación de STAT-1 y su translocación al núcleo. Para ello, se introdujo la actividad OH1 mediante dos estrategias, una clásica y otra utilizando un sistema de transducción basado en vectores herpéticos de tipo amplicón. Los resultados demostraron que OH1 inhibe de forma significativa tanto la translocación de STAT1 al núcleo como su fosforilación. Además, se generó el mutante catalítico OH1-C112S el cual constituye una herramienta para aislar potenciales sustratos. Utilizando este mutante se logró aislar a STAT-1 e identificar nuevos candidatos, entre ellos la proteína GAPDH, vinculada al metabolismo energético, el tráfico vesicular, y la respuesta mediada por interferón. Estos resultados abren nuevas hipótesis de trabajo que buscarán comprender como este tipo de factor de virulencia además de alterar la respuesta inmune también sería capaz de modular la actividad de enzimas implicadas en el metabolismo energético.

Contacto: dporley@fcien.edu.uy
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Resumen:
La presencia de coliformes en agua es ampliamente utilizada como indicador de contaminación fecal. En nuestro país, la legislación vigente incluye la determinación de coliformes fecales como uno de los parámetros más importantes para evaluar la calidad de los distintos cursos de agua. El método que se utiliza es el recomendado por Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, el cual consiste en la filtración por membrana de la muestra y posterior incubación en medio mFC a 44,5 ± 0,2 ºC durante 24 ± 2 horas. Esta temperatura de incubación es importante para la selectividad del método y su estricto rango de variación es un factor crítico para su aplicación en el laboratorio. La robustez de un método analítico se define como una medida de la susceptibilidad del método a pequeños cambios que pueden ocurrir en la rutina del análisis. Para evaluar la robustez, se somete el método a pequeños cambios en el procedimiento y se evalúa su influencia en los resultados obtenidos. En este trabajo ensayamos la robustez del método para determinación de coliformes fecales al variar la temperatura de incubación, a cuatro temperaturas diferentes, realizando en paralelo un control a la temperatura de referencia. Para ello se sembraron diluciones de un cultivo puro de E. coli a tres niveles de concentración y muestras ambientales de playas de Montevideo a dos niveles de concentración. Los resultados se evaluaron mediante ANOVA para los casos en los que se cumplieron los supuestos de normalidad y homogeneidad de varianzas, y el test no paramétrico Kolmogorov-Smirnov en los casos puntuales que no se cumplieron estos supuestos. Los resultados obtenidos sugieren una tolerancia de ± 0,5 ºC respecto a la temperatura de referencia del método. Se obtuvieron diferencias significativas de recuento cuando se amplió el rango de incubación en 1,5 ºC.

Contacto: nataliarodriguezuy@gmail.com
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Resumen:
Los trabajadores rurales, en especial  de tambos y predios ganaderos, son en Uruguay los más frecuentemente afectados por Leptospira, en niveles variados de severidad. La infección es más común en épocas de intensa lluvia e inundaciones. Afecta especialmente a varones jóvenes por contacto de su piel dañada o aparentemente sana con orina de ganado bovino,  principal reservorio y fuente de infección en nuestro país. El diagnóstico de esta enfermedad en el hombre y en animales se ha realizado habitualmente por investigación de la respuesta inmune específica. A partir de 2010 nos propusimos completar el diagnóstico, con finalidad fundamentalmente epidemiológica, mediante el aislamiento y caracterización de las cepas infectantes del ser humano, del reservorio animal y del ambiente húmedo donde pueden sobrevivir extensamente.  Reportamos  los resultados obtenidos a partir del cultivo entre 2010 y 2016 de 302 muestras de sangre de pacientes presuntamente positivos, extraída en la breve fase leptospirémica inicial de la enfermedad, y de 36 muestras de aguas recogidas en su ambiente de trabajo. Los cultivos se realizaron en medios líquidos EMJH y Fletcher;  las bacterias reconocidas en microscopio de campo oscuro se identificaron inicialmente por técnicas de PCR hacia secuencias de ADN que codifican 16S ribosomal y LipL32, lipoproteína superficial de cepas patógenas.  La caracterización se complementó por  Multilocus Variable number tandem repeat Analysis MLVA, y en algunos casos por PFGE, MLST o secuenciación parcial del genoma. Seis de 8 aislamientos humanos pudieron ser identificados como serogrupos y serovares diversos de L. interrogans y L. kirschneri. Cinco de 7 aislamientos ambientales fueron de L. biflexa, uno de Leptonema illini y uno de Leptospira meyeri. Los pacientes con hemocultivo positivo compartían el perfil laboral pero tenían edades mayores que la media de los infectados,  cursaban enfermedad en general más severa y probablemente bacteriemias más intensas y por eso detectables.  

Contacto: pmeny@higiene.edu.uy
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Resumen:
Escherichia coli forma parte de la microbiota gastrointestinal nativa de humanos y animales de sangre caliente. Sin embargo, existen variantes de E. coli altamente adaptadas, las cuales han adquirido atributos de virulencia que le permiten establecerse en distintos nichos y causar enfermedad en individuos sanos. E. coli productora de toxina tipo Shiga (STEC) se asocia a enfermedades en los seres humanos, siendo los bovinos su principal reservorio natural. STEC puede causar desde diarreas leves hasta colitis hemorrágica (CH) y síndrome urémico hemolítico (SUH), desencadenando en algunos casos la muerte. El factor de virulencia más destacado de STEC lo constituyen las toxinas tipo Shiga 1 (Stx1) y 2 (Stx2), dentro de las cuales se identifican diferentes subtipos. El grupo Stx1 está subdividido en 3 variantes, mientras que el grupo Stx2 está compuesto por 7 variantes. Particularmente, los subtipos Stx2a y Stx2d se asocian a casos severos de CH y SUH. Por otro lado, las variantes Stx2b, Stx2c, Stx2f, Stx2g y las de Stx1, se asocian a diarreas leves, fiebre, dolores abdominales, entre otros. Stx2e, por su parte, está asociado a enfermedad en cerdos. El objetivo de este trabajo consistió en subtipificar las toxinas Shiga 1 y 2 de una colección de aislamientos de STEC obtenidos de muestras de necropsias y heces de terneros mediante la técnica de PCR múltiple. Hasta el momento hemos detectado los subtipos Stx2a, Stx2c, Stx2d y Stx1a. Asimismo, algunos aislamientos resultaron positivos para la variante usualmente asociada a cerdos, Stx2e. Ningún aislamiento analizado presentó la variante Stx2b. Se observó además la ocurrencia de más de una variante en un mismo aislamiento en simultáneo. Los resultados parciales demuestran la potencialidad de STEC aisladas en bovinos en Uruguay de causar enfermedad severa en el hombre, resaltando el riesgo zoonótico y la necesidad de realizar detección temprana de este patógeno.  

Contacto: debitoe@hotmail.com
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Resumen:
Introducción: Staphylococcus aureus es un patógeno humano reconocido capaz de adquirir mecanismos de resistencia para distintos antibióticos. La resistencia a oxacilina se debe principalmente a los genes mecA o mecC que determinan CIMs para oxacilina mayores a 4 mg/L (MRSA). La expresión de estos genes es variable y se han descrito aislamientos portadores del gen mecA con CIMs para oxacilina menores a 2 mg/L (fenotípicamente sensibles) denominadas OS-MRSA. Objetivo: comunicar la recuperación de 2 aislamientos de S. aureus con antibiotipos diferentes a partir del mismo caso clínico. Materiales y métodos: se trata de una niña con osteomielitis de rodilla derecha de la cual se obtuvieron 2 aislamientos de S. aureus, uno a partir del líquido articular y otro de sangre. Ambos se identificaron por VITEK y se clasificaron como MSSA (articular) y MRSA (hemocultivo). Los 2 aislamientos fueron enviados al Departamento de Bacteriología y Virología para completar su estudio. La presencia del gen mecA y de algunos genes de virulencia se hizo por PCR. Se realizó ensayo de disco-difusión para oxacilina (OXA) y cefoxitina (FOX) según CLSI. La comparación genética se estableció por SmaI-PFGE. Resultados: Los 2 aislamientos portaban el gen mecA, fueron positivos para ETs A y B, y negativos para PVL y TSST. Ambos mostraron halos de inhibición para OXA > 15 mm (sensibles) y para FOX < 19 mm (resistentes). El aislamiento identificado como MSSA mostró un doble halo para OXA compatible con el fenotipo de hetero-resistencia. Los perfiles PFGE fueron idénticos. Discusión y conclusiones: Este reporte informa sobre problemas para identificar correctamente aislamientos MRSA cuando se utiliza sistema VITEK. Es recomendable que en procesos severos producidos por cepas clasificadas como MSSA por este método se realicen estudios adicionales para identificar correctamente los cultivos MSSA, OS-MRSA o MRSA involucrados.  

Contacto: guillermina.giudice@gmail.com
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Resumen:
Streptococcus pneumoniae continúa siendo el principal agente etiológico de la neumonía comunitaria siendo responsable de aproximadamente 4 millones de muertes, en el mundo.  Nuestro grupo de investigación ha estado trabajando con un modelo murino de colonización nasofaríngea por neumococo serotipo 1. Estudios previos sugieren que IL-17A sería un mediador clave en los mecanismos inmunes responsables de la eliminación de dicha colonización. Por tanto, nos ha interesado dilucidar cuáles son los mecanismos efectores de IL-17A que están involucrados en dicha eliminación. Considerando que ya ha sido descrito  que IL-17A induce la producción de péptidos antimicrobianos, citoquinas y quimioquinas reclutadoras de neutrófilos a la zona de infección, decidimos estudiar la expresión de estos mediadores en  tejido linfoide asociado a nasofaringe (NALT). Nuestros resultados muestran que la producción, a nivel de ARN mensajero, de péptidos antimicrobianos y citoquinas proinflamatorias es similar en ambas cepas. Sin embargo, sí se observa una diferencia significativa en las citoquinas Il4 e Il10, siendo mayor la expresión en los ratones Il17a^-/- con respecto a WT. A su vez, en resultados preliminares obtenidos por citometría  de flujo, observamos un mayor reclutamiento de células T reguladoras (en muestras de NALT) y un menor reclutamiento de neutrófilos (en muestras de lavado nasofaríngeo) en los animales Il17a^-/-en comparación con la cepa salvaje. En suma, estos resultados  sugieren que un “apagamiento” de la respuesta inmune en los ratones Il17a^-/-, dado por una mayor presencia de células T reguladores y una mayor expresión de citoquinas como IL10, podrían favorecer el mantenimiento de la colonización nasofaríngea por neumococo. Estos resultados nos motivan a seguir investigando el mecanismo de acción de esta citoquina, ya que sigue siendo central encontrar el mecanismo molecular que determina que los animales deficientes en IL17A no sean capaces de controlar y eliminar la colonización nasofaríngea por neumococo.

Contacto: paulacespedes1@gmail.com
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Resumen:
Las nanopartículas son agregados de material de dimensiones nanométricas. Dichas dimensiones les otorgan mayor área superficial y propiedades mecánicas, químicas, eléctricas, ópticas, magnéticas, y electro y magneto-ópticas, diferentes a las de sólidos de la misma composición, pero de mayor tamaño. Estas propiedades particulares de las nanopartículas les atribuyen sus muy promisorias aplicaciones. En particular, las nanopartículas de plata son agregados de átomos de plata (Ag⁰) cuya característica principal es su eficiencia absorbiendo y dispersando la luz, debido a la Resonancia de Plasmón de Superficie. La absorción de la luz varía significativamente con el tamaño y forma, así como la distancia entre ellas. Estas propiedades ópticas permiten el uso de las partículas metálicas en diversas aplicaciones, como el desarrollo de biosensores, diagnóstico y tratamiento de cáncer, liberación controlada de fármacos, y como agentes antimicrobianos. En este trabajo se realizó la biosíntesis de nanopartículas de plata a partir del caldo extracelular de una cepa de Phanerochaete chrysosporium, evaluando distintas condiciones a nivel de la incubación del micelio con el agua y en la reacción de síntesis. Con las nanopartículas sintetizadas se determinó el potencial antimicrobiano mediante ensayos de determinación de Concentración Inhibitoria Mínima (CIM) frente a fitopatógenos pertenecientes a los géneros Xanthomonas, Fusarium, Penicillium, Rhizopus y Botrytis. Los resultados obtenidos permitieron determinar las mejores condiciones para realizar la biosíntesis de nanopartículas de plata a mayor escala. A su vez las nanopartículas presentaron valores de CIM muy inferiores a los de la solución de nitrato de plata, demostrando su gran potencial antimicrobiano frente a los fitopatógenos evaluados. Agradecimientos: APIPES (SUM), CSIC I+D 1500, PEDECIBA Química.

Contacto: bestevez@fq.edu.uy
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Resumen:
El sorgo (Sorghum bicolor L. Moench) es uno de los cereales más cultivados en el mundo. En Uruguay la producción de sorgo en el año 2015 - 2016 alcanzó las 520 mil toneladas con un área plantada de 170 mil hectáreas aproximadamente, siendo su principal destino la alimentación animal y la producción de biocombusibles. La infección de los cultivos con Fusarium spp. genera importantes pérdidas en el rendimiento de las cosechas. Además, algunas especies son capaces de producir micotoxinas, que ocasionan un riesgo para la salud animal y humana. El objetivo de este trabajo fue aislar e identificar las especies de Fusarium presentes en granos de sorgo. Se analizaron 38 muestras provenientes de distintos departamentos. Se inocularon 100 granos de cada muestra en medio agar papa dextrosa y se incubó a 25ºC durante 5 días. Luego se cuantificaron y aislaron las especies de Fusarium presentes. La identificación se realizó por métodos morfológicos y moleculares. El 87% de las muestras analizadas presentaron infección por Fusarium spp. (769 aislamientos correspondientes a 8 especies) observándose diferencias entre las muestras en cuanto a la composición y frecuencia de especies. Dentro de las especies de Fusarium, F. graminearum fue la mas frecuente (79%), seguida de F. nygamai (11%) y F. semitectum (6%). Estos hongos son importantes productores de micotoxinas, a la vez que F. graminearum y F. nygamai son especies fitopatógenas. Por esta razón sería de interés evaluar la capacidad toxicogénica de las cepas aisladas y la presencia de micotoxinas en los granos de sorgo.

Contacto: moliver24@gmail.com
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Resumen:
Los camélidos además de los anticuerpos convencionales producen anticuerpos carentes de cadena liviana (sdAbs) en los que el sitio de unión al antígeno está formado únicamente por el dominio variable de 15 kDa de la cadena pesada (VHH). Debido a la ausencia de ”barajado” de las cadenas livianas y pesadas, el aislamiento de VHHs a partir de bibliotecas de expresión en fagos es más sencilla que en el caso de anticuerpos convencionales. Por otro lado, los VHHs se expresan con alto rendimiento en forma recombinante (nanobodies), tienen propiedades únicas de solubilidad y estabilidad, y constituyen versátiles dominios de especificidad para la construcción de quimeras, o chaperones para cristalización de proteínas. Con solo 3 CDRs la diversidad estructural del sitio de unión es menor que en los anticuerpos convencionales, pero esto no parece limitar su capacidad de reconocimiento y se han aislado nanobodies de alta afinidad contra todo tipo de antígenos. Una excepción parcial a lo anterior es el caso de las moléculas pequeñas (haptenos), que típicamente se unen a cavidades formadas en la interface de las cadenas livianas y pesadas en los anticuerpos convencionales. En esta presentación discutiremos estas propiedades de los nanobodies con ejemplos de aplicaciones llevadas adelante por nuestro grupo.

Contacto: ggonzal@fq.edu.uy
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Resumen:
La activación de receptores acoplados a la proteína G (GPCRs) resulta en la generación de  segundos mensajeros como AMP cíclico (AMPc) y GMP cíclico (GMPc). Esto promueve una cascada de eventos pleiotrópicos a nivel intracelulares cuyo resultado final depende de la adecuada compartimentalización de las señales dando lugar a circuitos funcionales de información. En dicho contexto, conocer la correcta discriminación espacio-temporal versus la distribución global de estos segundos mensajeros permitiría aumentar la especificidad de potenciales fármacos y reducir sus efectos adversos. Para ello es imprescindible entender la organización estructural que determina la función y regulación de los compartimientos individuales de cada segundo mensajero. Disecar estas vías de señalización requiere de procedimientos no invasivos y en tiempo real en células o tejido vivo. Por estos motivos, frecuentemente se emplean técnicas espectroscópicas para monitorear el cambio de fluorescencia por efecto FRET de sensores moleculares.Estos sensores están típicamente constituido por un modulo proteico capaz de ligar AMPc/GMPc generando una transición alostérica y una pareja de variantes espectrales de la proteína fluorescente verde (GFP) que cambian su orientación y distancia relativa como resultado del mecanismo alostérico. Usando una estrategia racional que combina bioinformática, modelado molecular, simulaciones de grano grueso, biología molecular y experimentos de fluorescencia, hemos desarrollado una nueva generación de sensores FRET (llamado CUTie) con una arquitectura innovadora, formada por dos módulos fluorescentes anidados en un dominio de plegamiento mínimo de unión al ligando que deja el extremo N-teminal libre para la fusión a otra proteína. CUTie permite detectar concentraciones de nucleótidos cíclicos intracelulares con una resolución sin precedentes, gran selectividad e independencia de sensibilidad al compartimiento que sea dirigido. Este avance tecnológico abre el campo de posibilidades para la ingeniería de nuevos sensores con distintas afinidades y potencial multifunción al poder acoplar diferentes módulos efectores a una sola molécula.

Contacto: fklein@pasteur.edu.uy
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Resumen:
La enfermedad de von Hippel-Lindau (VHL) es un desorden hereditario, autosómico dominante que predispone a la formación de una variedad de quistes y tumores benignos y malignos en diversos órganos. El gen de VHL es un supresor tumoral que codifica para una proteína (pVHL) la cual, integrada al complejo multiproteico VBC, determina la poliubiquitinación y posterior degradación por el proteasoma de las subunidades α del factor inducible por hipoxia (HIFα). Si bien en los últimos años se han descripto otras funciones de pVHL independientes de HIF y relevantes para el desarrollo tumoral, la regulación del nivel de subunidades HIFα sigue siendo su función mejor caracterizada.Tras demostrar mediante ensayos in vivo la patogenicidad de dos variantes de pVHL (P138R y L163R) caracterizadas por nuestro grupo se buscó analizar in silico su estructura y dinámica para contribuir al conocimiento de los mecanismos moleculares subyacentes. Se emplearon herramientas de modelado computacional (campo de fuerza clásico AMBER) para predecir estructura e interacciones proteína-proteína y proteína-solvente en complejos VBC-HIF (PDBID 1LQB) de cada variante P138R/L163R comparada a pVHL nativa bajo condiciones quasi-fisiológicas (caja de agua explícita TIP3P y contraiones, NPT a 310 K y 1 atm). La termodinámica de la interacción VBC-HIF fue también caracterizada usando la aproximación MM/PB(GB)SA.La estabilidad relativa de los complejos VBC-HIF formados con ambas variantes resultó ser menor que con pVHL nativa. Aun así, estos complejos se forman in vitro. Analizada la accesibilidad de Lys blanco de modificaciones postraduccionales determinantes de la estabilidad y funciones HIF independientes de pVHL, se detectaron diferencias que deben ser confirmadas in vitro. Los resultados obtenidos, sientan base para futuros estudios tendientes a determinar la implicancia de las modificaciones estructurales aquí caracterizadas in silico en los procesos de degradación y modificación de pVHL.

Contacto: cmatho@fcien.edu.uy
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Resumen:
HemR, de Leptospira, es un regulador de respuesta de la familia de proteínas OmpR/PhoB y controla el metabolismo del hemo, esencial para estas bacterias. Tras su activación por fosforilación, mediada por la histidin-quinasa HemK, HemR actúa como un regulador transcripcional dual: induce la expresión de genes codificantes para enzimas involucradas en la síntesis de hemo, e.g. el operón hemA, probablemente reclutando a la ARN polimerasa (ARNP); y simultáneamente reprime la expresión de proteínas catabólicas de degradación de hemo, e.g. el operón hmuO, impidiendo estéricamente la asociación de la ARNP al promotor. El operón hmuO (o hol) codifica entre otras para la hemo oxigenasa, un factor de virulencia en Leptospira patógenas. El objetivo de este trabajo consiste en desacoplar la regulación dual de HemR mediante mutagénesis dirigida en su bucle de transactivación, permitiendo su unión al ADN pero impidiendo el reclutamiento de ARNP. Los residuos mutados fueron seleccionados en base a alineamientos secuenciales y estructurales entre HemR y PhoB, y análisis estructurales de los complejos PhoB:ADN y ARNP:ADN, siguiendo una estrategia de diseño racional. Las variantes de HemR se expresaron en Escherichia coli y se purificaron por cromatografía de afinidad y exclusión molecular. La unión de los mutantes a los promotores hemA y hmuO fue confirmada por ensayos de retardo de movilidad electroforética. Inesperadamente, algunos mutantes se unieron al ADN incluso desfosforilados. Estos constructos mutados están siendo clonados junto a su promotor nativo en un vector “shuttle” para conjugar desde E. coli en una cepa knockout hemR^- de Leptospira biflexa. La expresión de los promotores será determinada por RT-PCR. Este trabajo contribuye a entender los mecanismos moleculares que aseguran la conexión estímulo-respuesta en el metabolismo del hemo, íntimamente ligado a la patogenicidad de Leptospira.  

Contacto: juanimelio@pasteur.edu.uy
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Resumen:
Las Ciencias de la Vida están viviendo una nueva revolución: poder ir desde la observación de detalles moleculares y sus interacciones, hasta su integración en mecanismos funcionales de organismos vivos. La Biología Estructural ha contribuido con estructuras 3D y propiedades bioquímicas de una enorme diversidad de moléculas biológicas. Hoy caminamos hacia enfoques sistémicos, integrando escalas temporales y espaciales de mayor magnitud. En este trabajo discutiré ejemplos de nuestro laboratorio, combinando aproximaciones complementarias para estudiar motilidad en bacterias.  La motilidad es esencial en quimiotaxis, nutrición, y también en la diseminación de bacterias patógenas. Elegimos el género Leptospira como modelo singular de locomoción. Estas Espiroquetas poseen sólo dos flagelos, determinantes de la morfología celular y de su capacidad de natación. En contraste con sistemas ampliamente estudiados, los flagelos de Leptospira no son extracelulares, sino que rotan confinados en el espacio periplásmico. Nuestros resultados revelan que la composición proteica del flagelo de Leptospira es inusualmente compleja. Centrando nuestro análisis en el filamento (prolongación que sobresale del motor y el gancho conector), además de la flagelina, hemos identificado varias proteínas adicionales. Las “flagellar coiling proteins” Fcp A y B [1], esenciales para la motilidad traslacional, y para la virulencia de especies patógenas. También se reclutan dos isoformas de FlaA, conservadas en todas las Espiroquetas. Resolvimos las estructuras cristalográficas de FcpA [2] y FcpB, que sorprendentemente revelan dos nuevos plegamientos proteicos, ausentes en la PDB. Estamos obteniendo mapas de densidad 3D por crio-tomografía electrónica de filamentos enteros de Leptospira, en los cuales podremos ajustar las estructuras cristalográficas. El filamento flagelar de Leptospira parece ser un ensamblaje supramolecular con marcada asimetría, lo que nos conduce a hipótesis nuevas sobre el mecanismo de natación de Espiroquetas.   [1] Wunder, Mol Microbiol (2016) 101:457-70. [2] San Martín, Acta Crystallogr F (2017) 73:123-9.

Contacto: alebus@pasteur.edu.uy
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Resumen:
Mosquitoes transmit a broad range of human diseases caused by viruses and protozoans, including dengue, chikungunya, zika and malaria. Immune signaling pathways have recently been shown to regulate anti-dengue and anti-Plasmodium immunity in mosquitoes. The three major immune signaling pathways (Toll, IMD, and JAK-STAT) that were originally described in Drosophila or mammals have been identified in Aedes aegypti and Anopheles gambiae. The Ae. aegypti JAK-STAT pathway has been shown to be an important component of the human anti-dengue responses, while the An. gambiae IMD pathway is a key pathway in anti-Plasmodium defenses. Immune enhanced mosquitoes have recently been generated by genetic engineering. Particularly, overexpression of Rel2, a positive regulator of the IMD pathway, renders Anopheles mosquitoes more resistant to Plasmodium. The same phenomenon is observed in Ae. aegypti infected with dengue virus when Dome, a positive regulator of the JAK-STAT pathway, is overexpressed. We are currently using CRISPR-Cas9 to generate specific knock out and knock in genetically modified mosquitoes to evaluate the antiviral potential of a set of DENV-modulated genes, newly identified in our laboratory through RNA-seq assays.  

Contacto: jaysneto@gmail.com
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Resumen:
Gene editing via CRISPR/Cas9 has prompted a recent revolution in molecular biology by enabling the fast, ease and low cost precise manipulation of genes and genomes. Here we will present some recent variations of this technology, which add new instruments into CRISPR/Cas9 toolbox: (i) regulation of gene expression, (ii) mutagenic chain reaction (MCR), (iii) base editing without DNA cleavage, (iv) heterologous expression of Cas9, (v) the use of ribonucleoproteins (RNPs), (vi) RNA tracking/cleavage and (vii) new nucleases (Cpf1, shorter Cas9 and high fidelity enzymes).      

Contacto: tiagocampospereira@ffclrp.usp.br
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Resumen:
Spats1 es un gen identificado previamente en nuestro laboratorio en la rata (Rattus norvegicus), de expresión específica del testículo y expresado diferencialmente durante el desarrollo testicular. En la primera onda espermatogénica, se expresa preferentemente en las células meióticas masculinas (Capoano et al., Gene Expr Patterns, 2010). La importante conservación evolutiva de este gen (desde cnidarios hasta humanos) sugiere la importancia de su función. Con el objeto de contribuir a la elucidación de la función de SPATS1 en relación con el desarrollo testicular y la espermatogénesis, generamos ratones knockout (KO) para el gen Spats1 mediante dos metodologías en paralelo: microinyección de células madre embrionarias genéticamente modificadas en embriones, y microinyección de CRISPR/Cas9 en cigotos. La realización de ambos abordajes para un mismo gen nos permitió comparar en términos cuantitativos la eficiencia de la aplicación de ambas metodologías en nuestro medio. En tanto la tecnología de células madre resultó de alta complejidad debido a la necesidad de cultivar células extremadamente delicadas y la imposibilidad de lograr transmisión del transgén a la línea germinal, la metodología CRISPR representó una enorme ventaja tanto en términos económicos como de rapidez, permitiéndonos generar los primeros ratones KO producidos enteramente en el Uruguay. La caracterización completa del fenotipo mutante incluyó análisis morfológicos, histológicos, moleculares y funcionales. Si bien evidencias recientes apuntan a la implicancia de SPATS1 en la fertilidad de los mamíferos, el fenotipo sutil encontrado en los ratones KO es consistente con resultados recientemente observados para otros genes vinculados a gametogénesis, que sugieren la existencia de redundancias que salvaguarden las funciones esenciales para la reproducción.

Contacto: adriana.geisinger@gmail.com
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Resumen:
Identificación de interactores in vivo de la proteína FhaA en micobacterias Mycobacterium tuberculosis, el agente etiológicos de la tuberculosis, es la segunda causa de muerte por un agente infeccioso a nivel mundial. PknG, una Ser/Thr-quinasa de proteínas, es un factor crucial  para la sobrevida de esta bacteria en el hospedero. Con el fin de elucidar las vías de señalización medidas por PknG, recientemente estudiamos su interactoma e identificamos nuevos sustratos de esta quinasa (1). En el presente trabajo caracterizamos uno de estos nuevo sustratos, la proteína FhaA, que contiene un dominio de reconocimiento de treoninas fosforiladas. Nos propusimos lacaracterización a nivel molecular de los complejos de señalización formados in vivo por FhaA, así como sus cambios dinámicos frente a diferentes estímulos que simulen el ambiente del hospedero. La estrategia experimental utilizada se basa en la sobre-expresión de FhaA conteniendo una etiqueta (Strep-tag) en M. smegmatis en combinación con el entrecruzamiento in vivo, purificación por afinidad y espectrometría de masa para obtener una instantánea de los complejos de señalización.  Nuestros resultados nos permitieron identificar una lista de 114 interactores directos o indirectos de FhaA, que incluye el único interactor previamente reportado (2). Con el fin de evaluar la contribución de residuos fosforilados en FhaA a las interacciones descritas, nos proponemos estudiar el interactoma de mutantes puntuales de FhaA en los residuos fosforilables. Finalmente obtuvimos el interactoma de FhaA cuando la micobacteria esta sometida a condiciones de hipoxia. La comparación de estos proteomas nos permitirá evaluar el rol de esta proteína en la adaptación al ambiente del hospedero.  (1) Gil, M. et al. Submitido JBC, Abril 2017.  (2) Roumestand, C. et al. Structure 2011, Structure 19:1525-1534.

Contacto: brivera@pasteur.edu.uy
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Resumen:
Las selenoproteínas contienen el elemento traza selenio como selenocisteína, 21er aminoácido, incorporado co-traduccionalmente a la cadena polipeptídica en un codón UGA. En ellas, la selenocisteína normalmente funciona como un eficiente catalizador redox. Del relevamiento previo surge que los tripanosomátidos portan un juego completo de genes para la maquinaria de biosíntesis de selenocisteína y su incorporación a tres selenoproteínas: SelK, SelT y Seltryp, siendo esta última parásito-específica. En este trabajo se estudió el selenoproteoma de especies de Kinetoplástidos en genomas recientemente secuenciados y se evaluó la relevancia in vivo de las selenoproteínas para los tripanosomas africanos. La búsqueda en bases de datos reveló que los genes para SelK, SelT y Seltryp están presentes en la mayoría de los Kinetoplástidos, incluyendo la especie de vida libre Bodo saltans, y que el de Seltryp se perdió en el subgénero Viannia de Leishmania. La homología y sintenia con persulfuro dioxigenasas y sulfotransferasas bacterianas sugieren un rol para Seltryp en el metabolismo del azufre. Una línea de Trypanosoma brucei knockout para la selenocisteína sintasa (SepSecS), incapaz de sintetizar selenocisteína, mostró una sensibilidad similar a la línea salvaje parental frente al estrés oxidativo inducido por exposición breve a altas concentraciones de metilglioxal o H₂O₂. Cabe destacar que la infectividad de la línea knockout, evaluada en un modelo de infección murino, no se vio afectada y no se detectaron aumentos en la expresión de proteínas involucradas en el metabolismo redox dependiente de tioles que expliquen efectos compensatorios. En suma, nuestros datos muestran que la supervivencia de los tripanosomas africanos en su hospedador mamífero no depende de la presencia de selenoproteínas y descartan que las mismas tengan un rol en su defensa antioxidante y/o virulencia. Sobre esta base, la idea de que las selenoproteínas puedan ser candidatos a blancos de fármacos para los tripanosomas africanos debe abandonarse.

Contacto: mbonilla@pasteur.edu.uy
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Resumen:
Las peroxirredoxinas (Prxs) son peroxidasas dependientes de tioles altamente ubicuas. La primera parte del ciclo catalítico consiste en la reducción del sustrato oxidante (hidroperóxido o peroxinitrito) al reaccionar con el tiolato (RS^-) de la cisteína peroxidática (C_P) que resulta oxidado a ácido sulfénico (RSOH). La reducción del RSOH a tiol en la segunda parte del ciclo depende de la Prx particular. La alquilhidroperóxido reductasa E (AhpE) de Mycobacterium tuberculosis tiene una única cisteína cuyo RSOH se reduce por micotiol/micorredoxina-1. M. tuberculosis está expuesto a sulfuro de hidrógeno (H₂S/HS^-) endógeno o formado por las células huésped, y se ha sugerido que podría modular su patogenicidad. Una de las formas como el H₂S/HS^- ejerce efectos biológicos es la modificación de cisteínas formando persulfuros proteicos (RSSH). En este trabajo mostramos que la reacción de AhpE-SOH con H₂S/HS^- equimolecular conduce a la formación de AhpE-SSH detectable por espectrometría de masa. Para caracterizar cinéticamente esta reacción se realizaron ensayos de competencia aprovechando 1) el cambio de fluorescencia intrínseco de la enzima que ocurre durante la sobreoxidación del AhpE-SOH (formación de AhpE-SO₂^-) al reaccionar con hidroperóxido en exceso y 2) el cambio de absorbancia que ocurre al reaccionar 5-tio-2-nitrobenzoato (TNB-S^-) con AhpE-SOH formando un disulfuro mixto (AhpE-SS-TNB). Ambos procesos resultaron inhibidos en presencia de H₂S/HS^-. Del análisis cinético surge una constante de formación de AhpE-SSH del orden de ~ 10³ M^-1s^-1 a pH 7.4 y 25ºC, cinco veces mayor que las reportadas para la persulfuración de albúmina humana o micotiolación de AhpE. Además, H₂S/HS^- podría ser un sustrato reductor alternativo al micotiol/micorredoxina-1, ya que se observó consumo catalítico del mismo en presencia de hidroperóxido y AhpE. La cinética del proceso está siendo caracterizada.

Contacto: marceloreyes26@gmai.com
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Resumen:
La aterosclerosis es una patología ampliamente distribuida en las sociedades occidentales, siendo las complicaciones de dicha enfermedad la causa número uno de muerte en nuestro país. En este contexto, nuestro grupo de investigación viene trabajando de forma activa en el desarrollo de potenciales fármacos para el tratamiento de enfermedades cardiovasculares y del metabolismo. En ese sentido hemos obtenido resultados muy promisorios con compuestos análogos de alfa-tocoferol, al que se adiciona un grupo funcional nitroalquenilo, para el tratamiento de enfermedades cardiovasculares. Por lo tanto, en la actualidad continuamos con el desarrollo eficiente de nuevos compuestos híbridos tocoferol-nitroalqueno. En este nuevo siglo, uno de los mayores desafíos de la química orgánica y de la química médica es la obtención de nuevos compuestos orgánicos estructuralmente diversos, de manera rápida, segura y eficiente, para estudiar sistemas biológicos y acelerar el proceso de descubrimiento de potenciales fármacos. Así, utilizamos como enfoque metodológico la síntesis orientada a la diversidad, a través de reacciones multicomponente, una de las estrategias sintéticas más prometedoras para la generación de una colección de moléculas pequeñas, ya que se obtienen nuevos compuestos con la diversidad estructural deseada en un paso de reacción con un mínimo de esfuerzo sintético, tiempo y formación de productos secundarios. En este trabajo se presentarán estudios iniciales utilizando las reacciones de Passerini (3 componentes, síntesis de alfa-aciloxiamida) y de Ugi (4 componentes, síntesis de alfa-bisamida) bajo condiciones de Química Verde, las cuales permiten incorporar los farmacóforos alfa-Tocoferol y nitroalquenilo de forma directa en un solo paso de reacción. Con este fin, se prueban diferentes condiciones para llevar a cabo estas reacciones, por ejemplo, utilizando agua como disolvente verde o condición libre de disolvente, tanto a temperatura ambiente como asistidas con microondas o ultrasonido como fuentes de calentamiento eficiente.  

Contacto: lucia.ines.colella@gmail.com
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Resumen:
La exposición excesiva a los rayos UV ocasiona diversos daños al organismo, entre ellos, quemaduras, fotoenvejecimiento y cáncer de piel. Existen diversos tipos de filtros solares aprobados para su uso sobre humanos. Los filtros UV actualmente autorizados se clasifican en dos tipos: inorgánicos y orgánicos. Dentro del primer grupo se encuentran el ZnO y TiO₂. Los filtros orgánicos se clasifican segun su estructura en ésteres, benzofenonas, dibenzoilmetanos, derivados del alcanfor, bencimidazoles y triazinas.  Algunos de los filtros solares utilizados actualmente poseen diversos efectos tóxicos sobre la piel o por absorción percutánea. Por ejemplo, la avobenzona es muy utilizada como filtro UVA pero no es fotoestable. Su irradiación causa fragmentación y  formación de arilglioxales y bencilos los cuales son sensibilizantes y citotóxicos. Otro problema importante es el relacionado con la contaminación ambiental. Los filtros solares se formulan para resistir el baño, sin embargo se estima que luego de 20 minutos de inmersión, el 25% de los ingredientes se liberan en el agua. Debido a la creciente demanda de filtros solares, es de gran importancia el descubrimiento de nuevos compuestos, más seguros y efectivos. Como continuación de una línea de investigación relacionada con la síntesis de filtros solares, en este trabajo se describe la preparacion de una serie de híbridos dibenzoilmetano-ácido cinámico, de estructura general Ph_A-CO-CH₂-CO-CH=CH-Ph_B donde Ph_A y Ph_B representan grupos fenilo; algunos de ellos no descritos aún en la literatura. Los compuestos se prepararon por tratamiento de 2’-hidroxiacetofenona con un cloruro de ácido para formar el correspondiente éster el cual luego fue sometido a un rearreglo de Baker-Venkataraman. Los compuestos fueron obtenidos con buenos rendimientos y caracterizados espectroscópicamente y posteriormente serán sometidos a estudios de fotodegradación.

Contacto: gjsagrera@gmail.com
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Resumen:
                Este trabajo tiene como objetivo principal la evaluación de derivados del Trolox™ (análogo hidrosoluble de la Vitamina E) como potenciales fármacos antiinflamatorios para la prevención/tratamiento de enfermedades cardiovasculares. El síndrome metabólico juega un rol fundamental en la patogénesis de estas enfermedades y se caracteriza por obesidad central, aumento de la glicemia y resistencia a la insulina, hipertensión arterial y dislipemia. En la base etiopatogénica de este síndrome, juega un rol central la obesidad patológica, caracterizada por la generación de un proceso inflamatorio crónico, estéril, desarrollado a bajo ruido a nivel sistémico, perpetuado por el tejido adiposo. En este sentido, la activación de las vías del inflamasoma está relacionada con la patogénesis de estas enfermedades. El inflamasoma es un complejo multiproteico señalizador que censa una gran variedad de moléculas del sistema inmune innato y que, su activación, produce la liberación de citoquinas proinflamatorias potentes (IL-1β e IL-18). Por este motivo, el desarrollo de nuevos fármacos antiinflamatorios, capaces de inhibir las rutas involucradas en la generación de procesos inflamatorios crónicos, en particular el inflamasoma, resulta fundamental. En nuestro laboratorio, hemos diseñado y sintetizado una nueva familia de fármacos formados por una estructura mimética del α-Tocoferol y un grupo nitroalquenilo que ejerce propiedades antiinflamatorias a través de la inhibición de Nfkb, del inflamasoma NLRP3, y de la activación de vías citoprotectoras (Nrf2/Keap1, HSF-1 y PPAR-g). Sintetizamos y evaluamos un análogo nitroalqueno derivado del Trolox™ (NATx0) que presenta resultados preliminares muy alentadores: posee alta reactividad frente a nucleófilos modelo, elevada inducción de enzimas dependientes del sistema Nrf2/Keap-1 (H0-1 y GCLM), inhibe NfkB, inhibe el inflamasoma NLRP3 en macrófagos THP-1 estimulados con LPS/ATP y disminuye la liberación de IL-1β en modelo de inflamación aguda en ratón por administración de LPS.

Contacto: dapuetor@gmail.com
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Resumen:
El cáncer de próstata (PCa) es el cáncer de mayor incidencia y el segundo en mortalidad en hombres. Aún no se dispone de marcadores que permitan distinguir entre las formas indolentes y las formas agresivas de la enfermedad, lo que conduce a la sobre-intervención médica que conlleva un aumento innecesario tanto de la morbilidad como de los costos de salud. Debido a su estabilidad, especificidad de expresión, accesibilidad en los fluidos corporales y simplicidad para la cuantificación, los microARNs constituyen una nueva oportunidad como biomarcadores en patología humana, además de presentar valor clínico en la predicción del tratamiento y la terapéutica.    Los microARNs que integran el clúster génico compuesto por miR-301b y miR-130b, han sido reportado como oncogénicos y supresores de tumor en diversos tejidos, habiendo en PCa reportes contradictorios. Aquí buscamos dilucidar su significación clínica en PCa, interrogando bases de datos de expresión génica de tumores que están disponibles públicamente.  Las mismas incluyen transcriptomas, metilomas, proteomas y diversos datos clínicos asociados a las muestras. Primeramente, se analiza la asociación entre los niveles de expresión de los dos microRNAs y el tipo de tejido prostático (normal, tumoral primario y secundario/metástasis), encontrándose un incremento de los mismos en tejido metastásico respecto al primario y en primario respecto al normal. En segundo lugar, se estudian los niveles de metilación del gen y su asociación con la expresión de los ARNs transcriptos, determinándose que si bien existe un leve incremento de la metilación de ADN del locus en tejido tumoral vs. normal, el mismo no afecta los niveles de microRNAs. Por último, se indaga si el nivel de miR-130b y 301b correlaciona con la evolución neoplásica, encontrándose una asociación con la recurrencia bioquímica y la metástasis. Estos resultados sugieren fuertemente una acción oncogénica de este locus en PCa.

Contacto: mduhagon@fcien.edu.uy
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Resumen:
En febrero de 2015 se reportó el primer brote autóctono de leishmaniasis canina en Uruguay, el mismo ocurrió en la localidad de Arenitas Blancas en el departamento de Salto. En la zona, un total de 49 perros fueron muestreados por test serológicos en donde 11 resultaron positivos para Leishmania sp; mediante captura entomológica se identificaron individuos de la especie Lutzomya longipalpis que posteriormente fueron confirmados positivos para Leishmania sp. Se realizó PCR y secuenciación de genes específicos tanto en las muestras caninas como en las muestras entomológicas y esto nos permitió alertar sobre la presencia del ciclo completo en nuestro país. También, mediante PCR-RFLP de tipificación, se logró determinar que la especie involucrada en el brote era Leishmania infantum. A partir de las muestras caninas identificadas en el brote, se obtuvieron cultivos axénicos estables de la forma promastigota de las cepas circulantes en medio semi-definido. Se procedió a la caracterización de las mismas mediante curvas de crecimiento y susceptibilidad a fármacos utilizados para el tratamiento de leishmaniasis. En una última instancia, también se logró establecer un modelo de infección en macrófagos humanos el cual representa una herramienta fundamental de trabajo hacia el conocimiento y caracterización de las cepas circulantes en nuestro país.

Contacto: pfaral@pasteur.edu.uy
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Resumen:
PtpA es un componente clave en la biología de Mycobacterium tuberculosis, tal como se ha demostrado en estudios con cepas mutantes en esta fosfatasa. Durante la infección PtpA alcanza el citosol de macrófagos dónde actúa sobre proteínas eucariotas. Nuestro grupo reportó recientemente cuatro potenciales sustratos eucariotas de PtpA. En este contexto, validar la interacción de la PtpA con estos candidatos a sustrato es fundamental para avanzar en el conocimiento de las vías celulares afectadas por este patógeno. Para ello era necesario disponer de una estrategia que permitiera evaluar en un contexto celular eucariota la interacción entre la PtpA de Mycobacterium tuberculosis y los candidatos a sustrato. Así, en este trabajo se logró poner en marcha el sistema de doble híbrido en levadura CytoTrap Vector (Stratagen) y se aplicó al estudio de la interacción entre la PtpA D126A (carnada en el sistema doble híbrido) y la proteína humana ECHA correspondiente a la subunidad alfa de la enzima clave de la beta-oxidación de los ácidos grasos  (presa en el sistema doble híbrido). En una primera etapa se insertaron los genes de interés en los plásmidos del sistema de doble híbrido mediante herramientas de biología molecular. Se logró clonar el gen de la PtpA D126A en el plásmido pSos, confirmándose la integridad de su secuencia bacteriana. Para la ECHA, se obtuvo el ADNc, y el producto de amplificación de dicho gen se clonó en el plásmido pMyr, confirmándose que corresponde a la isoforma 1 de la ECHA humana. Posteriormente se realizó el ensayo de doble híbrido, obteniéndose, en un primer experimento, el resultado esperado para los controles del ensayo y un resultado promisorio para la interacción de la PtpA-D126A y la ECHA humana. La etapa siguiente será aumentar el número de réplicas del ensayo para estar seguros de dicha conclusión.

Contacto: vivian.irving23@gmail.com
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Resumen:
Trypanosoma cruzi es el agente causal de la enfermedad de Chagas, considerada por la OMS como una enfermedad desatendida y un importante problema socio-económico en Latinoamérica. El parásito presenta diferentes estadíos a lo largo de su ciclo de vida. En el intestino del insecto vector se encuentran los parásitos en forma epimastigota no infectiva que se diferencian en el tracto rectal del insecto en tripomastigotas metaciclicos, estadío no replicativo responsable de la infección en mamíferos. Poco se sabe de la transición entre ambos estadíos. Experimentalmente se ha demostrado que el estrés nutricional desencadena el pasaje de epimastigotas a metacíclicos. Se ha propuesto que parásitos estresados en fase estacionaria constituirían un estadío diferente pudiendo diferenciarse a metacíclicos o volver al estadío epimastigota replicativo según las condiciones de estrés nutricional. Con el fin de caracterizar estos parásitos en fase estacionaria se realizaron curvas de crecimiento y se determinaron puntos claves para evaluar morfológicamente los parásitos mediante microscopía y citometría de flujo. Se estudiaron niveles de compactación de cromatina en los diferentes puntos mediante digestión del ADN con DNasa I a diferentes tiempos y se evaluó contenido de ARN por parásito. Se evaluó la resistencia al complemento de los parásitos mediante incubación con suero humano sin descomplementar y descomplementado por calor, para evaluar si estos parásitos en fase estacionaria son sensibles como los epimastigotas o resistentes como los tripomastigotas metacíclicos. En todos los casos se analizó la viabilidad de los parásitos mediante incubación con calceína y ioduro de propidio y posterior análisis por citometría de flujo. Estos resultados contribuyen a la caracterización de T. cruzi en fase estacionaria, un punto clave del ciclo de vida donde se determina su diferenciación hacia el estadio infectivo en la ampolla rectal del insecto.  

Contacto: fabricioh92@gmail.com
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Resumen:
Los cambios en los estilos de vida han determinado un constante incremento en la incidencia de enfermedades crónicas no transmisibles (ECNT), las que constituyen la principal causa de muerte a nivel mundial. Las complicaciones de la hipertensión arterial (HTA) producen una parte importante de los fallecimientos por ECNT. La injuria vascular constituye una de las principales consecuencias observadas en la HTA mantenida. Los mecanismos celulares y metabólicos involucrados en la injuria vascular son numerosos, complejos y multifactoriales, dentro de los cuales el sistema renina-angiotensina - aldosterona juega un rol protagónico. La Angiotensina II (ANGII) presenta un rol clave en la generación de inflamación, fibrosis, y apoptosis; modificaciones que se observan en la HTA. Sin embargo, los mecanismos moleculares que subyacen estos procesos aún no han sido completamente elucidados. Nuestro grupo ha venido trabajando en el rol de la proteína DBC1, un inhibidor de SIRT1, en la fisiopatología de las enfermedades cardiovasculares. Los ratones Knock Out (KO) para DBC1 están protegidos contra la aterosclerosis en situación de obesidad experimental. En este contexto, nos planteamos evaluar si DBC1 desempeña un papel relevante en la HTA. Los resultados obtenidos apoyan esta hipótesis. El tratamiento con ANGII in vivo induce la expresión de DBC1 tanto a nivel vascular como renal. Sorprendentemente, los ratones KO para DBC1 son más sensibles a la ANGII, mostrando una mayor tasa de mortalidad, mayor incidencia de aneurismas abdominales y alteraciones en la morfologia de la pared arterial. Por otro lado, a nivel renal parece existir una protección contra el daño producido por la AngII. Nuestros resultados sugieren que DBC1 juega un rol preponderante en las enfermedades cardiovasculares, aunque aún debemos comprender en profundidad los mecanismos involucrados.

Contacto: laura.colman@gmail.com
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Resumen:
La miocardiopatía chagásica es la manifestación más severa de la enfermedad de Chagas. A pesar de diversos estudios e investigaciones, su patogenia y los mecanismos biológicos responsables de las lesiones cardíacas no son aún comprendidos en su totalidad. En este trabajo identificamos vías biológicas alteradas en cardiomiocitos humanos a tiempos cortos de infección. Encontramos que a tan sólo 6 horas post-infección las mitocondrias aumentan su capacidad respiratoria junto con un aumento de su biogénesis. Esta respuesta puede deberse a que en los cardiomiocitos infectados se mostró un aumento en la activación de mTORC1 (mammalian target of rapamycin complex 1). Si bien un aumento de mTORC1 también supondría un aumento en la proliferación de estas células, no evidenciamos mayor proliferación en las células infectadas. Una de las vías biológicas que encontramos disminuida y que permitiría explicar esta aparente contradicción, es la vía de degradación del ARNm mediada por secuencias sin sentido (más conocido como NMD-Non sense mediated decay), dado que su disminución habilita, en el contexto de la infección, la expresión de genes responsables del arresto celular. El presente trabajo evidencia la complejidad de las múltiples interacciones huésped-parásito que ocurren a tiempos cortos de infección, las mismas pueden ayudar a comprender más profundamente la patogénesis de la miocardiopatía chagásica.

Contacto: glibisch@pasteur.edu.uy
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Resumen:
Las metacaspasas fueron descubiertas inicialmente a partir de datos de secuenciación de genomas vegetales, en base a homología de secuencia con caspasas de animales. Al igual que las caspasas, estas proteasas han sido implicadas desempañando roles fisiológicos diversos, más allá de su participación en la muerte celular programada. Su análisis filogénetico permite determinar que son ubicuas en el reino vegetal y que muy tempranamente divergieron en dos grupos estructuralmente diferentes: las metacaspasas de tipo I y II, siendo éste último exclusivo de las plantas. Physcomitrella patens es una briofita, que conserva varias de las características de las primeras plantas que colonizaron la tierra, por lo cual resulta interesante su estudio para el análisis evolutivo de esta familia de genes. En esta planta identificamos dos genes de metacaspasas de tipo I y cuatro de metacaspasas de tipo II, a la vez que también se identificó una secuencia que sería un pseudogen de metacaspasa. Esta temprana diversificación de los miembros de esta familia de proteasas, es apoyada por los diferentes niveles de expresión de los miembros de esta familia y por la diversidad de patrones de distribución subcelular que hemos encontrado. En este trabajo se muestran los estudios de localización subcelular de todas las metacaspasas de P. patens. Mayores estudios están siendo llevados a cabo a fin de contribuir a determinar la probable subfuncionalizacion de los miembros de esta familia.

Contacto: marcelb@fcien.edu.uy
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Resumen:
Las células están expuestas a especies reactivas de oxígeno y nitrógeno, originadas como subproductos metabólicos o en el medio ambiente. Una producción descontrolada y/o neutralización insuficiente de estos compuestos es capaz de alterar el equilibrio redox celular causando daño en las macromoléculas. Las células están equipadas con distintos sistemas que controlan la homeostasis redox tiol-disulfuro a nivel intracelular. En los tripanosomátidos, el tripanotión (bis-glutationilespermidina, tiol de bajo peso molecular) reemplaza el sistema ubicuo de glutatión. El desarrollo reciente de biosensores basados en proteínas fluorescentes que permiten monitorear el estado redox intracelular en tiempo real e in situ, de manera no invasiva, y  dinámica,  nos ha impulsado a validar el empleo de estas herramientas para estudiar los fenómenos redox que ocurren durante los procesos de respuesta a estrés, diferenciación celular e interacción huésped-parásito. Se han desarrollado variantes redox sensibles de la proteína verde fluorescente (roGFP2) capaces de monitorear el pool de glutatión reducido y oxidado. En este trabajo se utilizó un biosensor de tercera generación, una fusión de la glutarredoxina 1 humana (hGrx) y la GFP2 redox sensible (roGFP2) y se generó un nuevo biosensor con corrimiento espectral hacia el rojo (rxmRuby2). Este nuevo biosensor será de gran utilidad para imagenología in vivo sobre animales, tejidos o células, ya que en esa zona espectral no existe interferencia por autofluorescencia de moléculas endógenas. Se realizó la caracterización in vitro de la respuesta de la proteína recombinante hGrx-roGFP2 frente a los pares redox más relevantes para el parasito y se generaron las líneas reporteras transgénicas de Trypanosoma brucei y  de Trypanosoma cruzi. El nuevo biosensor rxmRuby2 fue expresado, purificado y caracterizado de manera  bioquímica. Análisis espectrofluorimétricos muestran que el biosensor es capaz de responder de manera reversible a estímulos redox a diferentes pH en el rango fisiológico.

Contacto: fsardi@pasteur.edu.uy
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Resumen:
Los abejorros del género Bombus (Hymenoptera; Apoidea) son insectos eusociales de ciclo anual. En la actualidad, son reconocidos como excelentes polinizadores debido a que presentan características que los hacen eficientes en diversos cultivos de importancia económica. Por tal motivo, sus colonias han comenzado a comercializar en muchos países. Los abejorros pueden albergar un gran número de ácaros de fácil transmisión, que afectan la vida de las colonias. Es posible que los sistemas de cría donde se encuentran en situación de confinamiento, aumente la incidencia de diferentes ectoparásitos. Entre éstos, se destacan diversos ácaros foréticos pertenecientes al amplio grupo Acariforme. En Uruguay, contamos con la presencia del abejorros nativo, Bombus atratus, la que ha sido sujeta a exitosas experiencias de cría en condiciones de laboratorio. En este estudio se analizaron abejorros de la especie B. atratus (75) criados en laboratorio y se determinaron las especies de ácaros presentes en sus cuerpos. Las diferentes especies encontrados fueron: Tyrophagus putrescentinae, Kuzinia americana, Pneumolaelaps longanalis P. longipilus. El 65% de los abejorros presentaron por lo menos un ácaro, dentro de los infectados la gran mayoría (95%) es hospedero de la especie T. putrescentinae. Las demás especies de ácaros se distibuyeron en el resto de abejorros analizados, y en un solo abejorro se dió el caso de una coinfección por dos ectoparásitos (T. putrescentinae y K. Americana). Si bien T putrescentinae, el más presente en las muestras, no afecta directamente la salud de los abejorros, está asociado a la falta de higiene de la colonia  y puede contribuir a la aparición de otras afecciones como microsporidios, hongos, etc. Este trabajo abre la posibilidad de implementar el estudio de la acarfauna como una herramienta para evaluar el estado sanitario de las especies de abejorros en el país, permitiendo así contribuir en su conservación.

Contacto: ortizadrianbiologia@outlook.es
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Resumen:
Pseudomonas aeruginosa es un patógeno oportunista capaz de causar la muerte a individuos inmunocomprometidos. Representa un problema importante a nivel de la salud, ya que es el 3^er o 4^to aislamiento hospitalario más común. Constituye la principal causa de muerte en individuos con fibrosis quística, siendo la formación de biofilms un factor clave en la resistencia a antibióticos y la cronicidad de la infección. La transición desde una forma de vida planctónica a una asociada a superficie, es un paso temprano crucial en la formación de biofilms y el establecimiento del proceso infectivo. En este sentido, el segundo mensajero 3´,5´-diguanilato cíclico (di-GMPc) juega un rol central en la transición desde un estado móvil y de vida libre a uno sésil, multicelular y asociado a superficie. La síntesis de di-GMPc es, catalizada por diguanilato ciclasas, mientras que su hidrólisis es catalizada por fosfodiesterasas. El genoma de P. aeruginosa codifica un gran número de enzimas con actividad diguanilato ciclasa y fosfodiesterasa, y en base a caracterizaciones fenotípicas de cepas donde estos genes han sido individualmente eliminados, se ha postulado que cada una de estas enzimas tiene un rol biológico diferente. En este trabajo caracterizamos una cepa de P. aeruginosa que sobreexpresa una fosfodiesterasa específica de di-GMPc. Utilizando estrategias proteómicas cuantitativas y ensayos fenotípicos demostramos que existen cuatro procesos o estructuras afectados en esta cepa: la formación de biofilms, el ensamblaje de flagelo, la expresión de quimioreceptores y la expresión del sistema de secreción tipo III. Mediante el uso de un mutante enzimáticamente inactivo pudimos demostrar que algunos de los procesos afectados no dependen de la actividad fosfodiesterasa. Basados en estos resultados inesperados nombramos a PA2133 como FcsR (Flagellar, chemotaxis and type III secretion Regulator).

Contacto: jrossello@pasteur.edu.uy
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Resumen:
El mal de Chagas es una enfermedad endémica de América Latina, potencialmente letal, y para la cual no existen terapias efectivas y seguras hasta el momento. Se estima que más de 10.000 personas mueren diariamente en el mundo por manifestaciones clínicas de esta enfermedad. El agente etiológico de la enfermedad de Chagas es el parásito protozoario Trypanosoma cruzi, el cual cursa un ciclo de vida entre el insecto vector (vinchuca) y el hospedero vertebrado (hombre). La etapa aguda de la infección en el hombre se caracteriza por elevadas parasitemias, invasión tisular e infiltrado inflamatorio. En esta fase la respuesta inmune innata, en particular la acción de las células fagocíticas, es fundamental para neutralizar la invasión del parásito. Entre los principales mecanismos efectores de estas células se encuentra la formación de radical superóxido intrafagosomal por parte de la enzima NADPH oxidasa o Nox2. Este radical puede generar daño oxidativo en el parásito gracias a la formación de especies derivadas como el peróxido de hidrógeno o el peroxinitrito (producto de reacción con óxido nítrico). Evidencias previas en este y otros modelos de infección a macrófagos muestran que la enzima Nox2 es crucial para el control de infecciones por microorganismos. En este trabajo, realizamos infecciones en macrófagos derivados de ratones KO para Nox2 y demostramos que la ausencia de esta actividad enzimática resulta en una pérdida dramática de la capacidad de controlar la infección.  Por otro lado, resultados preliminares de infección in vivo de ratones KO con T.cruzi muestran que, si bien las parasitemias no empeoran, la invasión tisular es mayor en los ratones deficientes en Nox2 y los animales mueren prematuramente. La literatura presenta resultados contradictorios en este aspecto y es importante dilucidar el rol de Nox2 en la infección por T.cruzi para entender la biología de la interacción parásito-hospedero.

Contacto: carolinaprolo@gmail.com
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Resumen:
La geosmina es un compuesto generado por diversos microorganismos en la tierra y agua. En el suelo es formado por estreptomicetos y es el causante del olor “a tierra” que surge luego de una lluvia. En el agua existen algas y cianobacterias que producen geosmina, 2-metilisoborneol y otros compuestos que confieren al agua olor y sabor a moho y tierra. Las actividades humanas favorecen la proliferación de algas y cianobacterias por lo que muchas veces aparecen olores y sabores desagradables en aguas de consumo, que son difíciles de eliminar. Químicamente es un derivado trisustituido del biciclo[4.4.0]decano. Como tal, esta estructura posee tres átomos de carbono quirales y por tanto ocho estereoisómeros posibles (cuatro pares de enantiómeros). Específicamente, la geosmina natural es  (-)-(4S, 4αS, 8αR)-4,8-dimetiloctahidronaftalen-4-ol. Los humanos pueden detectar este compuesto a concentraciones muy bajas en el agua (del orden de nanogramos en un litro). La cuantificacion de geosmina en aguas se puede realizar por métodos cromatográficos (GC o HPLC). En ambos casos se debe disponer de un estándar, el cual tiene un costo elevado (aproximadamente 500 dolares americanos los 5 mg). En este trabajo, que se encuentra en etapas iniciales en nuestro laboratorio, se describe una aproximación a la sintesis de geosmina. El compuesto se obtuvo (como mezcla de estereoisómeros) en tres etapas: reaccion entre 2-metilciclohexanona con etilvinilcetona para formar un intermedio biciclico el cual se trata con 1,2-etanoditiol para formar un tiocetal y posterior desulfurizacion con níquel Raney. Los intermedios de reaccion y el producto final fueron obtenidos con rendimientos moderados y caracterizados espectroscópicamente (RMN y EM). En una etapa posterior se planea realizar la síntesis de la (-)-geosmina    

Contacto: gjsagrera@gmail.com
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Resumen:
Una cadena polipeptídica en el contexto celular puede adoptar una o mas conformaciones alternativas, sin embargo poner en evidencia las diferentes conformaciones constituye un desafío. En el marco de una línea de investigación de nuestro laboratorio centrado en las variaciones de conformación del receptor de estrógenos en células MCF7, analizamos su perfil de degradación por quimotripsina, mediante electroforesis y western blot.  La proteólisis limitada en una aproximación experimental muy sensible y la detección mediante el uso de anticuerpos requiere conocer con precisión su  especificidad respecto al receptor de estrógenos.  En este trabajo se describen las condiciones de cultivo celular de células MCF7, la preparación de los extractos celulares y de los inmunoprecipitados empleando dos anticuerpos monoclonales desarrollados contra el receptor de estrógenos, para comparar las proteínas reconocidas por ambos anticuerpos y validar los resultados.

Contacto: marcosdavyt@gmail.com
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Resumen:
La 2,4 DiEtilamina (2,4-DE) es un agroquímico herbicida sintético, amina secundaria del ácido-2,4-diclorofenoxiacético (2,4-DCFA). De acuerdo con OMS, derivados del 2,4-DCFA son agroquímicos clase II (moderadamente peligrosos). Su mecanismo de acción comprende oxidación vía óxido nítrico, teniendo como blanco diversas moléculas centrales para la vida celular. Se usa extensivamente en Uruguay (aprox. 1000 toneladas/año/2011). Existen pocos estudios de sus efectos sobre la salud humana. En este trabajo evaluamos el efecto a exposición aguda de 2,4-DE sobre la función cardíaca. La cinética de aplicación de este agroquímico a dosis 1 uM,  muestra que alcanza el estado estacionario en efectos en 10-15 minutos. Las curvas dosis-respuesta (CDR)  en estado estacionario de amplitud de tensión,  muestran un efecto bifásico con un efecto inotrópico negativo entre 0-5 uM e inotrópico positivo entre 5-20 uM. Las CDR de tensión sistólica (TS) y diastólica (TD)  muestran también un comportamiento bifásico, disminuyendo ambas hasta 2 uM 2,4-DE. La CDR de tiempo medio de activación decae monofásicamente, con un IC50 de aprox. 13 uM. No se observaron cambios significativos para el tiempo medio de relajación. La frecuencia cardíaca también mostró un comportamiento bifásico, subiendo aprox. 30% a dosis menores a 1 uM, para disminuir y estabilizarse con dosis mayores a 1 uM. A dosis entre 0.5 y 10 uM aumenta marcadamente la generación de comportamientos arrítmicos, consistiendo éstos sobre todo en extrasístoles, pausas extrasistólicas y focos ectópicos, produciendo alteraciones de contractilidad. Estos resultados son consistentes con al menos un blanco de acción en los receptores Ryr-2, dado el cambio en tiempo medio activación y el comportamiento bifásico de la liberación de calcio, ante oxidación de los mismos.

Contacto: florencia26savio@gmail.com
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Resumen:
  El azinfosmetil (AZM) es un agroquímico sintético insecticida del grupo de los organofosforados, clasificado por la OMS de acuerdo a su toxicidad y riesgo ambiental como clase Ib (altamente peligroso para la salud). Como todos los organofosforados (OF), sus efectos neurotóxicos se deben a inhibición de la acetilcolinesterasa por reacción de su forma Glutaoxón con el grupo hidroxilo de Serina en sitio activo de la acetilcolinesterasa. Al respecto, comparte este mecanismo de acción con el Malatión, que sufre el mismo proceso. Desde el año 2016, por res. 107 del MGAP, su uso en el país se ha prohibido totalmente. Este OF ha sido y es usado también como arma química, a pesar de estar prohibido su uso por la Convención de Ginebra. En este trabajo decidimos evaluar si al igual que otros OF, AZM puede actuar directamente en corazones aislados y retroperfundidos mediante el método de Langendorff. La cinética de acción se da en plazos de perfusión más prolongados que para otros OF, demorando aprox. 10-30 min en llegar al estado estacionario. Nuestros resultados indican que AZM, al igual que otros OF tiene también un efecto inotrópico negativo, con un IC50 de 20 + 10 uM. La tensión diastólica aumenta con dosis crecientes de AZM. Los tiempos medios de activación y relajación aumentan 150% y 40% respectivamente. Tiene también un efecto cronotrópico negativo en dosis similares a las que provocan inotropismo negativo. Se acompaña de trastornos del ritmo frecuentes consistentes en contracciones alternantes y extrasístoles ventriculares frecuentes, especialmente a dosis intermedias. Estos datos sugieren que AZM es capaz de ejercer efectos a nivel cardíaco, independientes de su acción anticolinesterasa, probablemente por efectos en canales de Calcio tipo L/Ryr2 y/o potasio, dada la inestabilidad observada en procesos que dependen de la homeostasis de Calcio intracelular.

Contacto: florencia26savio@gmail.com
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Resumen:
El clorpirifós (CPF) es un insecticida organofosforado (OF) sintético, que tiene efectos directos en la contractilidad y excitabilidad cardíacas, según reportamos en Alonso et al., 2015 y 2017 (ver resumen en este evento). En situación control, la restricción a la retroperfusión con Tyrode 1.8 mM, anula la capacidad contráctil cardíaca en aprox. 4 minutos en cobayos, reestableciéndose en un 100% en aproximadamente 3 min de reperfusión. Cuando se someten los corazones aislados a una dosis de CPF comercial de 13.7 uM, la contractilidad disminuye y aumenta con la reperfusión, con una cinética similar a la situación control. Sin embargo los valores de amplitud contráctil alcanzados en la reperfusión son francamente inferiores (50%), al restablecimiento de 100% que se observa en la situación control. Este porcentaje de recuperación cae a 33% cuando se incrementa la dosis de CPF de 13.7 a 41.1 uM. La frecuencia cardíaca (fc) cae y se recupera de manera similar al inotropismo ante control y  CPF comercial. Sin embargo la recuperación de la fc ocurre siempre a un 100% respecto a la situación anterior tanto en situación control como en exposición aguda a CPF comercial. No se observó un incremento de la tasa de arritmias entre la isquemia y reperfusión de situación control respecto a la misma ante exposición aguda a CPF comercial en dosis de 13 a 41 uM. Interesantemente, el uso de cardioprotectores opiáceos (remifentanilo 10 nM), empeora dramáticamente la situación frente a la exposición aguda a CPF comercial, conduciendo a la fibrilación ventricular. Nuestros resultados sugieren que CPF en dosis uM, altera corrientes por canales de Calcio-L u otros pro-contráctiles, (observadas en situación de independencia de isquemia o reperfusión), cambiando el efecto agonista de remifentanilo por un efecto antagonista del mismo cuando ha sido sometido previamente a la exposición aguda de CPF.

Contacto: romicardozofourcade@hotmail.com
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Resumen:
El clorpirifós (CPF) es un agroquímico sintético insecticida del grupo de los organofosforados, clasificado por la OMS de acuerdo a su toxicidad y riesgo ambiental como clase II (moderadamente peligroso para la salud). Actúa por inhibición reversible de la acetilcolinesterasa. Previamente, reportamos que la exposición aguda a CPF comercial es capaz de originar daño directo a nivel cardíaco, independientemente de su acción anticolinesterasa (Alonso et al, 2015). Sin embargo, los excipientes sintéticos podrían explicar estos hallazgos. Con el objetivo de demostrar que los efectos observados se deben mayoritariamente al principio activo CPF de los preparados comerciales, repetimos los experimentos con el agroquímico purificado analíticamente. Nuestros resultados en corazones aislados muestran que la cinética de acción de CPF puro ejerce sus efectos a los 3 min de su aplicación extracelular, pudiendo estar limitado por la perfusión del sistema. Al igual que el preparado comercial, CPF puro tiene un marcado efecto inotrópico negativo (IC50~40µM). El preparado puro al igual que el comercial, aumenta marcadamente la tensión diastólica (aprox. 10 veces). La velocidad de relajación con CPF puro, disminuye aprox. 20% y la de activación aumenta aprox. 20%. CPF puro es también cronotrópico negativo al igual que su preparado comercial con IC50 comparable. Ambos originan arritmias del tipo alternancia mecánico-eléctrica a dosis similares a las observadas para sus efectos crono e inotrópico. Estos resultados muestran que CPF ejerce directamente sus efectos sobre corazones aislados, posiblemente a través de canales de Calcio L, potasio y/o receptores de ryanodina/SERCA, independientemente de su acción anticolinesterasa y que los efectos reportados previamente por nuestro grupo, tampoco se explican por excipientes agregados a los preparados comerciales.  Financiado por CSIC I+D 146 a GF

Contacto: romicardozofourcade@hotmail.com
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Resumen:
La albúmina sérica humana (HSA) está formada por tres dominios y contiene una única cisteína libre (Cys34) localizada en el dominio I (DomI). Las escasas defensas antioxidantes del plasma y la alta concentración de HSA la convierten en blanco de especies oxidantes. Este trabajo busca profundizar en la caracterización de los derivados oxidados de la Cys34 utilizando el DomI recombinante producido en la levadura Pichia pastoris. La proteína es secretada al medio de cultivo del cual se purificó por precipitación con sulfato de amonio. Junto con el DomI precipitó un pigmento de color marrón que podría corresponder a una mezcla compleja derivada de carbohidratos, con carga neta negativa. Para separar el pigmento del DomI se evaluaron dos cromatografías considerando un punto isoeléctrico de 5.4 para el DomI. Primero se realizó una cromatografía de intercambio aniónico (DEAE sefarosa; amortiguador inicio: acetato de amonio 20 mM, pH 5.2; elución: acetato de amonio 20 mM, pH 5.2, NaCl 1 M). Si bien se logró una purificación parcial del DomI, parte del pigmento quedó fuertemente adsorbido a la resina dificultando su regeneración. Segundo, se evaluó una cromatografía de intercambio catiónico (CM sefarosa; amortiguador inicio: acetato de sodio 20 mM, pH 5; elución: acetato de sodio 20 mM, pH 5, NaCl 1 M). El análisis por espectrofotometría y SDS-PAGE mostró la presencia de la mayor parte del pigmento y proteínas contaminantes en la fracción no unida, mientras que el DomI se encontró en el eluido. Al determinar la concentración de proteína de las fracciones con el método del ácido bicinconínico se observaron interferencias debido al pigmento, mientras que el método de Bradford resultó más adecuado. Actualmente se está trabajando en la reducción y cuantificación del tiol de la Cys34 para posteriormente comenzar con los ensayos cinéticos y estructurales.

Contacto: martinasteglich@fcien.edu.uy
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Resumen:
El cáncer, es el resultado ­­­­­­de alteraciones en ciertos genes que inducen el crecimiento descontrolado de células malignas. Esta enfermedad es la segunda causa de mortalidad más frecuente en el mundo y en general los tratamientos para combatirlo son poco eficaces y seguros por lo que la búsqueda de nuevos compuestos con acción anti-tumoral es de suma importancia. Recientemente, compuestos con acción liberadora de óxido nítrico (NO) han tenido un gran impacto para su potencial uso como anti-tumorales, y se ha comprobado que su actividad biológica anti-proliferativa está directamente relacionada con la capacidad liberadora de NO. La mayoría de los métodos que se utilizan actualmente para determinar la proliferación celular sólo miden un parámetro celular, por lo que son limitados y propensos al error. Este trabajo describe la determinación de la actividad anti-proliferativa in vitro a través de la medida de la actividad metabólica y la masa celular junto con la actividad liberadora de NO utilizando de una serie de ensayos en tándem para la misma muestra empleando los ensayos de resazurina, sulforodamina B y Griess. Adicionalmente, se evaluó el posible mecanismo de acción de los compuestos a través del ensayo cometa. En el presente estudio, se ha logrado desarrollar una forma rápida, sencilla, económica y reproducible para determinar la actividad anti-proliferativa y liberadora de NO en una misma muestra evitando la variación asociada con los diferentes ensayos y cambios de las condiciones externas. Los resultados obtenidos para los compuestos derivados de furoxano que fueron evaluados con esta serie de ensayos en tándem, mostraron una importante acción anti-proliferativa. Se ha demostrado una vez más que la entidad liberadora de NO es fundamental para obtener la actividad biológica deseada y responsable de inducir daño al ADN en células tumorales.

Contacto: floperezlobo@gmail.com
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Resumen:
Los organismos están constantemente expuestos a especies reactivas de oxigeno (ROS), que se producen como productos secundarios del metabolismo o como efectores, y pueden oxidar proteínas, lípidos y ácidos nucleicos. Cuando la producción de especies reactivas supera la capacidad antioxidante, resulta en un estrés oxidativo que puede contribuir al daño celular y al envejecimiento. Uno de los principales blancos del daño oxidativo son las proteínas, dada su abundancia y reactividad. Recientemente encontramos que ciertas oxidaciones llevan a la formación de productos electrofílicos, particularmente en Tyr, His y Trp, que pueden seguir reaccionando y podrían constituir un mecanismo importante de daño proteico. En este trabajo estudiamos la formación de derivados electrófilos en péptidos y proteínas como indicadores del estado oxidativo. Para ello se sintetizaron distintas sondas nucleofílicas que nos permiten detectar dichos derivados, y se trabajó con glutatión conjugado al grupo fluorescente  fluoresceína (FGSH).  Las primeras pruebas se realizaron en el dipéptido glicil-tirosina (GY), que cuando se oxida con oxígeno singulete genera el derivado electrofílico glicil-HOCHDA (GH). GH reaccionó con la sonda FGSH, y el aducto fue caracterizado por espectrometría de masa y cuantificado por UV-HPLC. Luego se utilizó la proteína ribonucleasa, esta se oxidó utilizando diferentes sistemas: oxígeno singulete, radical peroxilo (generado por ABAP), radical hidroxilo (peróxido de hidrógeno y Fe²⁺) y peroxinitrito. En todos los casos se evidenció la formación de productos electrófilos mediante la unión covalente con F-GSH. Los aductos en proteínas se cuantificaron utilizando cromatografía de exclusión molecular con detección UV-vis y fluorescencia. Se observó una variación cuantitativa en la formación de productos electrófilos generados por los distintos sistemas que eventualmente podría usarse como huella dactilar. Se sigue trabajando en la identificación de las modificaciones oxidativas y residuos que llevan a la formación de electrófilos en esta proteína.

Contacto: anclalop@fcien.edu.uy
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Resumen:
La alta concentración a la que se encuentran las macromoléculas en el interior celular, lleva a un hacinamiento molecular que provoca particulares condiciones fisicoquímicas en el citosol y demás compartimientos celulares. En este trabajo proponemos que la alta densidad a la cual las proteínas están presentes en bioambientes celulares, permite reacciones radicalares de propagación entre diferentes cadenas polipeptídicas. En este trabajo estudiamos la propagación de modificaciones oxidativas proteicas en soluciones de albúmina sérica bovina (BSA) a concentraciones que simulan el hacinamiento molecular celular, mediante estudios de oximetría, fluorescencia, y resonancia paramagnética electrónica. Por otro lado, estudiamos el efecto de compuestos derivados de nitronas, tert-butil-fenilnitrona (PBN) y dimetilpirrolina N-oxido (DMPO), sobre los fenómenos de propagación observados. Clásicamente, estos compuestos han sido utilizados para evidenciar la formación de radicales en reacciones químicas o enzimáticas. A su vez, estos compuestos han sido probados en diferentes modelos animales de enfermedad, e incluso en ensayos clínicos, como agentes para la protección de modificaciones oxidativas. Por tanto, utilizamos estos agentes en nuestros experimentos y demostramos que tanto PBN, como DMPO, fueron capaces de interrumpir la propagación de reacciones radicalares. Estos resultados apoyan el concepto de que en ambientes hacinados, el daño oxidativo puede ser inducido y amplificado via reacciones radicalares en cadena, mediados por proteínas y dependientes de oxígeno, y que a su vez, compuestos atrapadores de espín son capaces de interrumpir la propagación de estas modificaciones.

Contacto: aaicardo@gmail.com
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Resumen:
Nuestro grupo de trabajo estudia el efecto del uso diferencial de codones sobre la cinética de traducción y su relación con la estructura y funcionalidad del transportador de urea de Aspergillus nidulans, UreA. Dentro de esta línea se generó un mutante de este transportador en el cual dos codones de uso poco frecuente (codones 24 y 25; 24/25) que codifican para aminoácidos presentes en el extremo N-terminal de UreA, se sustituyeron por dos codones de uso frecuente. El resultado fue una disminución en los niveles de UreA en la membrana celular y por ende un crecimiento deficiente sobre urea. Se comprobó que estos efectos no se debían a una mayor degradación del transportador ni tampoco a diferencias en los niveles de ARNm entre la cepa salvaje y el mutante, ni a alteraciones en la estructura secundaria. En base a estos resultados, la hipótesis del grupo es que la mutación sinónima de los codones 24/25 afecta etapas muy tempranas en la síntesis de UreA. Se plantea entonces la posibilidad de que la mutación en los codones 24/25 fuera la responsable de la pérdida de una pausa traduccional. Ésta sería necesaria para la correcta interacción de los complejos ribosoma-cadena polipeptídica naciente que traducen UreA (RNC-UreA) con la partícula de reconocimiento de señal (SRP). Para determinar el posible rol de los codones 24/25 en la interacción de los RNC-UreA con SRP, se están desarrollando experimentos basados en ensayos de traducción in vitro de A. nidulans. Para realizar estos experimentos es necesaria la producción de anticuerpos que reconozcan a SrpA (proteína de A. nidulans homóloga a Srp54, subunidad más conservada del complejo SRP). Para cumplir con este fin se llevó a cabo la producción en forma recombinante de SrpA en Escherichia coli.  

Contacto: agusgonzalezcifuentes@gmail.com
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Resumen:
Los gliomas son los tumores más peligrosos del sistema nervioso central con una alta incidencia de muerte dependiendo de las características y estadío al momento del diagnóstico. La ausencia de marcadores confiables sobretodo en etapas tempranas y terapias anti-glioma eficaces conspiran contra el pronóstico favorable para quienes sufren de esta enfermedad. La investigación en ambas problemáticas es altamente dependiente de modelos animales que reproduzcan fielmente los tumores humanos. Los modelos de trasplante celular son de los más populares, sin embargo, los hallazgos patológicos de los tumores inducidos son a menudo diferentes de los gliomas humanos y la demanda de inmunosupresión que usualmente requiere el trasplante impide reproducir las interacciones tumor-microambiente que ocurren en los pacientes. En este trabajo se presenta el desarrollo tumorigénesis cerebral utilizando el carcinógeno N-metil-N-nitrosourea (MNU) en forma directa o indirecta.  La modalidad de trasplante singénico ortotópico de células transformadas con MNU en animales inmunocompetentes logró inducir neoplasmas únicos en el 90% de los animales inyectados, en ubicaciones y a tiempos reproducibles en todos los casos. La caracterización primaria reveló que los tumores desarrollados son infiltrantes y expresan marcadores de células madre tumorales y de precursores de progenitores gliales. La masa tumoral primaria presenta zonas proliferativas con células gigantes que muestran núcleos atípicos multi-lobulados y vasos sanguíneos de apariencia anormal. Todas características, similares a las encontradas en gliomas humanos y difícilmente reproducibles en los modelos usuales. Dado que el modelo desarrollado supera varias de las principales desventajas asociadas a los modelos de trasplante celular proponemos que puede ser una potencial herramienta para el estudio de la biología básica de los gliomas, así como para la investigación diagnóstica y terapéutica.

Contacto: ignacio.mastandrea@gmail.com
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Resumen:
Los persulfuros (RSSH) son probables intermediarios en la inducción de los efectos fisiológicos reportados para el sulfuro de hidrógeno (H₂S) en mamíferos. Este trabajo muestra la puesta a punto de un método para obtener preparados de persulfuros con el fin de estudiar su estabilidad y sus propiedades como nucleófilo y electrófilo. Se ha reportado que se obtiene persulfuro de cisteína a partir de cistina por acción de la cistationina β-sintasa (CBS)¹. En primer lugar, se purificó CBS humana trunca, carente de los 143 aminoácidos C-terminales, a partir de una cepa BL-21 (DE3) de Escherichia coli transformada con el plásmido pGEX4T1/hCBSΔC143 que codifica para la CBS unida a la glutatión S-transferasa. La CBS fue purificada por cromatografía de afinidad con glutatión sefarosa y la etiqueta removida con trombina. Una vez obtenida la enzima, se incubó con cistina para formar persulfuros, que fueron cuantificados por el método de cianólisis fría. Este método consiste en la reacción entre cianuro y los persulfuros para formar tiocianato y en la posterior detección del tiocianato formado con cationes férricos en medio ácido que forma un complejo coloreado que absorbe a 460 nm. Se comparó el rendimiento a distintos tiempos y diferentes concentraciones de sustrato y enzima. Además, se evaluó el efecto generado por la adición de piridoxal-5’-fosfato, el cofactor catalítico de la CBS. Si bien este método presenta ciertos inconvenientes debido a la baja solubilidad de la cistina, se logró formar persulfuros de cisteína exitosamente, aunque se obtuvo un rendimiento bajo, 3-4 % respecto a la cistina inicial. Actualmente se está explorando la formación de H₂S a partir de la reacción entre glutatión y el persulfuro de cisteína obtenido a partir de cistina y CBS. ¹Yadav, P.K. et al. J. Am. Chem. Soc., 2016, 138, 289-299.

Contacto: dbenchoam@fcien.edu.uy
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Resumen:
Gymnotus omarorum es una especie solitaria de pez eléctrico, de descarga débil dulceacuícola, que se distribuye en la región subtropical sudamericana siendo, dentro del orden Gymnotiformes, la especie más ampliamente distribuida y abundante en Uruguay. G. omarorum constituye un tradicional modelo neuroetológico que ha aportado al conocimiento anátomo-funcional de electrorrecepción activa. Recientemente, se ha identificado que esta especie de pez teleósteo despliega agresión exclusivamente territorial, única hasta el momento, lo que lo converte en un modelo de elección para la búsqueda de mecanismos neuroendócrinos que modulan este comportamiento. Un escollo importante para el desarrollo de estas investigaciones es la falta de información genómica de la especie, que imposibilita abordajes moleculares como la evaluación de la expresión génica diferencial. Con dicho objetivo, se secuenciaron de manera masiva muestras de ARN provenientes de cuatro tejidos distintos de dos ejemplares de esta especie, obteniendo 20 millones de lecturas pareadas por tejido. Las secuencias fueron analizadas conjuntamente y se ensambló un transcriptoma de referencia utilizando Trinity. Distintos programas como Transrate, Transdecoder, Blastx, Trinotate, Findorf, GhostKOALA e Interpro fueron utilizados para depurar el ensamblado y corregirlo, así como para encontrar transcriptos codificantes para proteínas y proceder a su anotación. Brevemente, el transcriptoma de referencia cuenta con 284.000 transcriptos, donde 30.000 representan el 90% del total de valores de expresión. Mientras que Transdecoder identificó 94.000 ORFs de más de 100 aminoácidos, Findorf encontró 48.600 proteínas, siendo la mitad full length. Se construyó un archivo de anotación muy extenso, para el transcriptoma generado, con información para casi 50.000 de los transcriptos identificados. Este trabajo aporta por primera vez información genómica de la especie mediante la secuenciación del transcriptoma y la anotación de genes de G. omarorum y se suma al banco de datos de otras 4 especies del orden Gymnotiformes disponibles en www.efishgenomics.integrativebiology.msu.edu. Financiación: ANII-FCE_1_2014_1_104272

Contacto: g.eastman.roge@gmail.com
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Resumen:
La enfermedad de Chagas es una enfermedad potencialmente mortal causada por el parásito protozoario Trypanosoma cruzi, y constituye un importante problema de salud pública principalmente en América Latina, perteneciendo al grupo de las enfermedades desatendidas. En busca de potenciales agentes antichagásicos, se sintetizó y caracterizó un nuevo compuesto basado en vanadio. En este trabajo se evaluó la actividad de este compuesto, el cual muestra valores de IC₅₀ en el rango micromolar sobre T. cruzi con un buen valor de índice de selectividad. Para evaluar el efecto de estos compuestos en la morfología de parásitos tratados, se tomaron imágenes de microscopía. Se observa en estos parásitos morfología redondeada, pérdida de flagelo y pérdida de movilidad a medida que aumenta la concentración de compuesto. Con el fin de profundizar el estudio del modo de acción del mismo, se utilizaron sondas fluorescentes como marcadores de apoptosis y necrosis, para determinar el mecanismo de muerte celular que induce. En las condiciones analizadas no se observa una tendencia directa a la muerte celular por ninguno de los mecanismos estudiados. La complementación de este ensayo con marcadores de viabilidad y vitalidad celular para determinar el efecto sobre el metabolismo celular, no mostró cambios significativos de la actividad esterasa en parásitos tratados. Además, se observa una disfunción mitocondrial mediada por una inducción del colapso del potencial de membrana. Para ampliar este análisis biológico, se analizaron los cambios globales en el transcriptoma de parásitos incubados con el complejo. Por ontología génica se observan modificadas las funciones oxidorreducatasa y de transporte transmembrana y a nivel celular las mitocondrias. Se espera al profundizar este análisis identificar posibles vías afectadas para entender el modo de acción de este prometedor compuesto. Por otro lado, se pretende complementar estos análisis con estudios proteómicos.

Contacto: mmosquillo@fcien.edu.uy
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Resumen:
En el Río de la Plata y en los grandes embalses de nuestro país y la región las floraciones de Microcystis dominan el fitoplancton especialmente durante la temporada estival, y sus efectos ecosistémicos requieren mayor atención. En estos cursos de agua los niveles de toxinas (microcistinas, MCs) alcanzan máximos estacionales de 10-20.000 µgL^-1 o más,  representando un riesgo muy elevado para humanos o animales tanto por contacto directo como por consumo de agua o alimentos contaminados. Hemos desarrollado métodos inmunoquímicos sencillos, selectivos y económicos para determinar MCs en agua y para el estudio de bioacumulación en tejidos animales. Sin embargo, es necesario complementar estas determinaciones con herramientas bioanalíticas que permitan detectar sus efectos tóxicos en forma sencilla. Para ello, se realizaron dos bioensayos utilizando “madrecitas de agua” (Cnesterodon decemmaculatus), especie nativa del Sur de Sudamérica, la cual representa una buena herramienta para evaluar la calidad ambiental de los recursos hídricos. Los bioensayos se realizaron con una floración de Microcystis sp. (conteniendo MCs entre 16 y 5500 µgL^-1) durante 96 horas (n=10 por duplicado de cada dosis). La concentración de MCs totales de la floración se analizó mediante ELISA y sus variantes químicas fueron identificadas por MALDI-TOF, detectándose mayoritariamente MCLR, acompañada por MCRR. Con los resultados del primer bioensayo (55-5500 µgMCsL^-1) se pudo estimar un valor CL₅₀ para esta floración (aprox. 1000 µgMCsL^-1). Los peces se fijaron para análisis histopatológico. Aún a concentraciones subletales, la histopatología mostró efectos notorios en diversos tejidos como edema branquial, alteración de la arquitectura del hígado, intestino con zonas de necrosis y pérdida de unión celular. Si bien se requieren mayores estudios, dado que es una especie presente en numerosos ecosistemas acuáticos,  estos resultados sugieren que C. decemmaculatus  tiene potencial como especie centinela de exposición a MCs.

Contacto: nbadagian@fq.edu.uy
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Resumen:
    La biodiversidad es el resultado de los procesos de especiación y extinción. Importantes preguntas se generan en torno a determinar cómo un proceso continuo de cambios puede producir grupos discretos a los que denominamos especies. Por este motivo, los procesos y mecanismos que conducen a la formación de estas entidades biológicas  están en permanente revisión. Esto se debe a nuevas capacidades de análisis aportadas por la genética molecular, la genómica y otras “òmicas” y a importantes desarrollos conceptuales en campos como la sistemática y la genética de poblaciones. Los límites específicos pueden ser definidos como fenotipos/genes/regiones genómicas que permanecen diferenciadas en fase de la potencial hibridación e introgresión. Los límites específicos son semipermeables (“porosos”),  en dónde la permeabilidad (intercambio genético) es función de la región genómica considerada. Las evidencias tempranas de la existencia de límites específicos semipermeables entre taxones emparentados, proceden de las evidencias de introgresión diferencial en zonas híbridas. Una zona híbrida es un área en donde se encuentran y reproducen poblaciones divergentes, produciéndose al menos en parte de su progenie, mezcla entre diferentes linajes genéticos. Desde el punto de vista de la Biología Evolutiva, las zonas híbridas son áreas consideradas como "laboratorios naturales, “ventanas de los procesos evolutivos”. En este trabajo presentamos la contraposición entre 2 modelos de estudio en peces endémicos de la región Neotropical, con evidencia de zonas de contacto primario o secundario, ambos procesos de diferenciación reciente de tipo Post-Pleistocénico. Por un lado, el grupo de especies continentales de peces anuales del género Austrolebias y por otro,  peces estuarinos tales como el pejerrey del genéro Odontesthes. En ambos casos, la diversidad genética encontrada y los procesos de hibridación natural detectados, representan un desafío en la diferenciación específica, delimitación de especies y stocks, así como en la definición de Unidades para la conservación.    

Contacto: ggarcia@fcien.edu.uy
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Resumen:
Introducción. Tacuarembó está ubicado al Nordeste del país, ocupa el territorio más extenso entre los 19 departamentos, fue uno de los asentamientos de las poblaciones indigenas que existieron en el Uruguay (Charruas, Minuanes y Guaraníes). La región ha sido poblada con oleadas sucesivas de migrantes principalmente de origen Español e Italiano y por Africanos y Portugueses, provenientes del Brasil. Los estudios para determinar la ancestralidad de esta población con marcadores clásicos y uniparentales han demostrado su composición tri-híbrida lo que refleja parte de su historia. Las inserciones Alu, son marcadores de ADN estudiados ampliamente en distintas poblaciones a nivel mundial ya que proporcionan una valiosa información para estudios de ancestralidad y diferenciación genética de las poblaciones humanas. El objetivo de este trabajo fue estimar las frecuencias alélicas de tres inserciones Alu (APOA1, ACE y TPA25) en la población de Tacuarembó y su comparación con las frecuencias reportadas previamente en la población de Montevideo. Materiales y Métodos. Se estudió una muestra de 64 individuos no emparentados naturales de Tacuarembó. El ADN fue extraído de sangre. Se determinaron los genotipos por PCR y electroforesis en agarosa. Las frecuencias alélicas y AMOVA se calcularon con el programa GenAlEx v.6.5. Resultados. En la población Tacuarembó se estimó para APOA1 una frecuencia de la inserción de 0,82, para ACE de 0,27 y para TPA25 de 0,367. La mayor diferencia en las frecuencias alélicas al comparar Tacuarembó con Montevideo fue para el locus TPA25 (0.367 vs 0.278 respectivamente). La media del coeficiente de diferenciación (Fst) entre Tacuarembó y Montevideo fue del 0.40%. Conclusión. Los resultados obtenidos en las muestras analizadas para las tres inserciones Alu no indican diferencias significativas entre la población de Montevideo y Tacuarembó.

Contacto: yassve2@gmail.com
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Resumen:
Sturgeons are target species for caviar production and are considered among the most valuable commercial fishes. Studying sex determination and differentiation is an important issue to understand their biology and has applications both in fish conservation and production. The goal of this work is to identify genes involved in Siberian sturgeon sex determination and differentiation. A gonad transcriptome database has been build after sequencing and assembling 15 samples of gonads coming from fish at undifferentiated stages (critical period of sex change) from 3 to 5 months old, mo) and differentiated male and female  (>8 mo). A candidate gene strategy approach was applied to identify pro-testis and pro-ovarian genes involved in sex differentiation as well as sex determinant genes described for vertebrates.  Expression level of genes selected in reads per million was compared statistically between stages and sexes. Sex determinant genes searched were not present at stages studied. A first set of pro-testis genes involved in somatic cell proliferation and androgen synthesis and regulation had maximum expression levels at 3 mo (sox9, irr, dhh, sdr5a2, cyp11c), while a second set dax1, gata 4, fog2 were highly expressed later at 5-6 mo together with lhx9, sf1 and mfge8 which are involved basically in Sertoli and Leydig cell development. In putative females, beta-catenin is highly expressed at undifferentiated stage  while a second set of pro-ovarian genes were over expressed (aromatase, fst, foxl2, hsd17b1) at 5-6 mo. Steroid synthesis genes expression shows an early potentiality these hormones. Our data shows that pro-ovarian genes and estrogen synthesis potentiality appear very early in ancient fish and remain conserved in modern fish, but pro-testis genes detected in sturgeons are more closely related to male pathways described in mammals than those described in modern

Contacto: vizziano@gmail.com
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Resumen:
Las Topoisomerasas catalizan corte y unión de las hebras de ADN, permitiendo el pasaje de una sobre la otra para liberar la tensión generada por el super-enrollamiento. El objetivo del presente trabajo fue estudiar el rol de la Topoisomerasa-II en relación a letalidad y mutagenesis inducidas por radio-quimioterapia tumoral. Los agentes usados fueron: cisplatino (genera principalmente aductos con el ADN y uniones covalentes intercatenarias), y rayos-X (generan principalmente roturas simples y dobles de las hebras de ADN). Se trabajó con poblaciones del eucariota Saccharomyces cerevisiae: cepa silvestre JN-362a y cepa isogénica deficiente en Topoisomerasa-II JN-362a-top2, ambas auxotróficas para adenina. Las dosis fueron: para cisplatino 1mM-3mM y para rX 40-120 Gray. Los tratamientos fueron realizados en medio nutriente líquido y en fase de crecimiento exponencial. La frecuencia relativa de sobrevivientes fue determinada mediante las colonias formadas en medio nutriente sólido y la frecuencia mutagénica (reversión ade→ADE) se determinó mediante el número de colonias formadas en medio sólido sin adenina. Se observó que, sometida a cisplatino, la cepa JN-362a-top2 presento menor sobrevida y mayor mutagénesis que la cepa JN-362a, acorde a lo esperado. Sorprendentemente, expuesta a rX, la cepa deficiente en Topoisomerasa-II presentó mayor sobrevida y menor mutagénesis que la silvestre. Postulamos, para el caso de daños generados por rX, que la presencia en concentraciones normales de Topoisomerasa-II permite un amplio e inespecífico acceso a enzimas de reparación dando lugar a la acción de aquellas error prone. Para el caso de daños generados por cisplatino la presencia de Topoisomerasa-II favorece la acción de enzimas más específicas y eficientes. Estos resultados preliminares sugieren que, además del tipo de daño del ADN, el estado topológico de esta macromolécula determina el grupo enzimático que procesa sus lesiones.

Contacto: mrfasanello@gmail.com
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Resumen:
Background: Cestode parasites are responsible for various worldwide zoonosis of great public health concern. Meanwhile, other tapeworms like Mesocestoides corti are an interesting model for the study of developmental biology. As genomic sequences of parasitic helminths are becoming available, novel questions regarding gene expression, development and their regulation are now possible. Small RNAs have been proven to modulate the gene expression in different organisms and while they have been sequenced in numerous Cestodes, little is known about their role in development and gene regulation on these species.   Results: To gain some insights on the expression profile of miRNAs through the life cycle, we compared already published data of six cestode species adding a novel dataset of M. corti. We found that, although miRNA expression varies between species and stages, there is a reduced set of miRNAs that are highly expressed at all moments probably acting as regulatory housekeeping. Since draft genomes are available we compared the genomic location of identified miRNAs, and found that while genomic location is conserved within cestode, synteny is less conserved respect to more distant species like trematodes. To further characterize if there are miRNAs conserved among platyhelminthes that have not been reported yet, we made a de-novo miRNA prediction on four flatworm genomes. To assess possible functions of the miRNAs detected we used the M. corti dataset to predict putative targets on 3’UTRs of annotated transcripts. Then, to verify the functional correlation of predictions, we look the annotation of predicted targets of a set of miRNAs that were reported to be differentially expressed between two developmental stages.   Conclusions: This work is the first attempt to describe and functionally analyze the miRNA role in the development of cestodes. This will be potentially useful in the design of new strategies of control.

Contacto: sfontenla@fmed.edu.uy
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Resumen:
Se estima que 80% de los habitantes de la tierra dependen de la medicina folklórica para sus necesidades de atención primaria que en su mayor parte implica el uso de plantas. En países desarrollados, la medicina basada en el uso de productos naturales ha ganado popularidad en parte por la creencia de que son productos seguros, están asociados a una vida saludable y son “amigables con la naturaleza”. A pesar de su potencial uso terapéutico, aún queda mucho por ser estudiado especialmente en relación a sus posibles efectos adversos o tóxicos. Se ha demostrado que diversas plantas presentan un amplio espectro de actividades biológicas antiinflamatorias, antioxidantes y anticarcinogénicas. Entre las enfermedades crónicas que afectan la población mundial, el cáncer constituye una de las principales causas de morbilidad y mortalidad. Por tanto, la investigación de las plantas o sus derivados como fuente de agentes terapéuticos o preventivos de la carcinogénesis es de alta relevancia.  Recientes estudios en células humanas indican que los aceites esenciales de hojas de Pitanga tienen propiedades antioxidantes pero carecen de efectos citotóxicos o genotóxicos. Bajo la hipótesis de que E.uniflora constituye una fuente de agentes moleculares que pueden prevenir la iniciación y/o progresión tumoral, hemos estudiado los efectos antiproliferativos del aceite esencial de hojas de Pitanga. Este se obtuvo por hidrodestilación a partir de hojas jóvenes del árbol VIII.7 localizado en la Estación Experimental de Facultad de Agronomía, Salto. Usando Saccharomyces cerevisiae, se determinó la cinética de proliferación de poblaciones celulares control y tratadas con aceite esencial de E.uniflora. Se observó modificación de la cinética de proliferación celular concentración dependiente. La determinación de la viabilidad celular durante el estudio de proliferación demostró la ausencia de efecto citotóxico. Estos resultados sugieren una alteración del ciclo celular como causa del retardo o inhibición de la proliferación celular.

Contacto: gferragu@fq.edu.uy
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Resumen:
Sturgeon caviar has become seafood production with strong economic production in aquaculture (Diana 2009). Along with any economy raising, illegal and deceitful products might be encountered, e.g. mix caviar of different species sold to the price of the most expensive one. Knowing transposable elements (TEs) repertoire can be used as a strategy to figure out whether caviar is made of only one or various sturgeon species using different approaches: phylogenetic studies as made in the present work, inventory of non active TE at species-specific positions along the orthologous genomic regions of sturgeons, TE PCR amplification and sequencing looking for TEs specificity. Transposable elements (TEs) are mobile and repeated sequences that are major factors of diversity and evolution in genomes. We report here through the analysis of gonad transcriptomes of the Siberian sturgeon Acipenser baerii, a non-teleost ray-finned fish, that sturgeon genomes contain many families of TEs, which are expressed in gonads and might be involved in the evolution of this divergent fish lineage. The high diversity of TEs observed in sturgeons, which is also found in teleost fish, coelacanth and amphibians but not in birds and mammals, strongly supports that many TE families were present in ancestral vertebrate genomes. Two types of transposable elements potentially differing in their evolutionary dynamics have been further characterized: DIRS-like retrotransposons, with a single lineage mainly transmitted vertically, and Tc1/mariner DNA transposons, with multiple lineages and the possible involvement of horizontal transfer. This first global analysis is a new step toward the understanding of TE evolution and evolutionary impact in non-teleost ray-finned fish, and will help to annotate the upcoming sequences of the large sturgeon genomes.

Contacto: vizziano@gmail.com
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Resumen:
Sturgeons are target species for caviar production and considered among the most valuable commercial fishes. They are found and cultured in the northern hemisphere and were introduced for production in the southern hemisphere > 20 years ago. They are also important to study vertebrate genomes evolution because their genome probably underwent a Whole Genome Duplication enabling the emergence of new gene functions. Their large genomes are still difficult to assemble. Multi-tissues transcriptomic resources are therefore an alternative to study physiological and molecular controls of different process such as reproduction, growth or nutrition. A multi tissue database (stomach, liver, kidney, heart, muscle, brain, hypophysis, gonads, skin, swimming bladder) was built for Acipenser baerii. Four different transcriptome de novo assemblies have been produced with DRAP with two assemblers (Trinity and Oases) and two strategies: read sets merging and per tissue assembled contigs merging. The resulting assemblies have been compared on several metrics including contigs count, total nucleotide count, read realignment rate, number of Lepisosteus oculatus proteins reconstructed with at least 80% identity and 80% protein length, BUSCO and transrate scores. The best assembly includes 71,263 contigs for a total length of 118,836,837 bases and a mean contig size of 1,667 nucleotides; and between 91% and 98% of the reads map to the contigs depending on the tissue. It includes 95% of the 2586 searched BUSCO genes. This assembly has been annotated with different databases such as Uniprot-Swissprot, refseq-protein, Gadus morhua, Lepisosteus oculatus, Danio rerio, Oryzias latipes, Homo sapiens Ensembl proteins. It has also been processed with InterPRoScan, RNAmmer and tRNAScanSE. Reads have been realigned on the contigs to produce expression levels as well as SNPs and INDELs. The variations have been functionally annotated. All the results have been uploaded in an RNABrowse instance which will be accessible at http://sturgeontissuedb.sigenae.org.

Contacto: vizziano@gmail.com
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Resumen:
Caracterización Morfológica y Molecular de Variedades Italianas de Olivo (Olea europea L) instaladas en el Jardín de Introducción de INIA “Las Brujas”. ¹Bernal, J., ²Conde, P., y ¹Pereira, J. 1Departamento Biología Vegetal, Facultad Agronomía, Av. Garzón 780, 12900 Montevideo, , Uruguay 2Instituto Nacional de Investigación Agropecuaria, Las Brujas. Uruguay. La olivicultura se desarrolla en Uruguay desde fines del siglo XVIII, y a partir de 1990 adquiere una gran expansión con nuevas plantaciones y variedades introducidas desde el área Mediterránea. En el año 2002, el Instituto Nacional de Investigación Agropecuaria, comienza la instalación de un Jardín de Introducción de Variedades de diversas procedencias, con la finalidad de evaluarlas agronómicamente en las condiciones de nuestro país. Con el objetivo de asegurar la identidad genética a esas variedades, se realizaron, análisis que permitieran corroborar los nombres de las mismas. Este requisito es corriente en cualquier Banco de Germoplasma o Jardín de Introducción, a los efectos de darle mayor seguridad a los resultados de las evaluaciones de estos materiales genéticos, ya que son frecuentes en el proceso de importación, errores de etiquetado o nomenclatura. En este trabajo se caracterizaron diez y seis variedades procedentes de Italia, plantadas en el año 2005. Se analizaron características morfológicas de hoja, fruto y endocarpo a 40 muestras por variedad. Asimismo se aplicaron diez pares de microsatélites diseñados para olivos, evaluados en otros ensayos realizados en bancos de germoplasma de referencia como los más discriminantes para el objetivo propuesto. Los resultados morfológicos y moleculares, al ser comparados con la base de datos del Banco Mundial de Germoplasma de Córdoba (España) detectaron algunos errores en los nombres asignados a las variedades analizadas, corrigiéndose la identificación. Esta caracterización confiere mayor certeza a los resultados de las evaluaciones agronómicas en curso. Trabajo financiado por INIA y Fondo de Dedicación Total (CSIC)

Contacto: jennifer.bernal4141@gmail.com
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Resumen:
Los ratones Tr-J, modelo murino de Charcot-Marie-Tooth1E (CMT1E), principal neuropatía periférica humana, presentan junto a esta afección, una parálisis espástica y un temblor generalizado (presente desde los 11 días  de vida), que podría indicar un compromiso central. La PMP22 ha sido descrita en algunos sectores del cerebro, en el tronco encefálico y en motoneuronas espinales de ratas y ratones. Sin embargo, ni la expresión del gen normal ni la del mutado han sido aun claramente establecidas en el SNC. Se ha demostrado además, que pacientes portadores de neuropatías hereditarias presentan desmielinización de la sustancia blanca. Previamente,  observamos niveles de pmp22 y su proteína, PMP22, incrementados en el citoplasma y núcleo de neuronas hipocampales y de Purkinje en TrJ respecto del wt. En el presente trabajo evaluamos el fenotipo neurodegenerativo TrJ en la región de la Sustancia Nigra (SN), con dos abordajes: 1) mediante  inmunomicroscopía confocal cuantitativa (para los marcadores PMP22, p53, melan A, Tau-1, actina, neurofilamento) y 2) a través de la cuantificación de neurotrasmisores por HPLC. La expresión del fenotipo neurodegenerativo TrJ se manifiesta a nivel de la SN, en la expresión diferencial de PMP22, p53 y Tau-1 y en los niveles de Dopac y dopamina. El fenotipo central muestra también en TrJ una regresión en el desarrollo y distribución de la vasculatura, junto a una notable estenosis. Esta alteración podría indicar, junto al hallazgo, en TrJ, de niveles reducidos del ARNm del citocromo b y alteraciones en los niveles de ADN mitocondrial (que hemos realizado recientemente),  la existencia de un  metabolismo oxidativo alterado asociado al fenotipo neurodegenerativo. Una exploración de la actividad mitocondrial, podría permitir determinar la repercusión funcional de tales alteraciones. Estos hallazgos sugieren un compromiso sistémico del Sistema Nervioso, cuyas consecuencias podrían modificar el alcance y la comprensión del síndrome CMT.

Contacto: monicabube@gmail.com
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Resumen:
La Aromatasa B y la NADPH-citocromo P450 reductasa son enzimas de la ruta esteroidogénica que convierten los andrógenos en estrógenos. Diversos estudios reportan altos niveles de expresión de Aromatasa B en la glía radial y gran producción de estrógenos, los que están implicados en la proliferación celular. Estas características pueden representar una adaptación ligada a la neurogénesis continua que se sabe que ocurre a lo largo de toda la vida de los peces. Se ha observado que la actividad NADPH-diaforasa en el encéfalo de los peces está presente en neuronas nitrinérgicas y también en células gliales posiblemente dada por la actividad de la reductasa esteroidogénica. El objetivo de este estudio es analizar mediante inmunorreactividad la presencia de Aromatasa B y la marcación mediante histoquímica de las células con actividad NADPH-diaforasa en el encéfalo del pez teleósteo Austrolebias charrua. Estos marcadores se analizaron en combinación con bromodesoxiuridina (BrdU) como marcador de proliferación celular para determinar si las células Aromatasa B+ y NADPH diaforasa+ son proliferantes. El análisis por microscopía óptica y confocal mostró que algunas células radiales ubicadas en las zonas ventriculares presentan actividad NADPH-diaforasa, inmunorreactividad frente a la aromatasa B y son BrdU+. También se detectaron más profundas en el parénquima, neuronas nitrinérgicas con actividad NADPH-diaforasa. En diferentes protocolos de estudio, se pudo constatar la colocalización de BrdU con células NADPH-diaforasa+ y  con células Aromatasa B+; y que algunas células radiales presentan doble marcado para la Aromatasa B y la actividad NADPH-diaforasa. Estos resultados presentan a las glías radiales de Austrolebias charrua como células proliferantes con actividad esteroidogénica y con actividad NADPH-diaforasa probablemente resultado de la enzima reductasa de la ruta esteroidogénica.

Contacto: maxitorres-tdd@hotmail.com
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Resumen:
INTRODUCTION: The endoplasmic reticulum (ER) is fundamental for membrane trafficking and secreted protein synthesis in eukaryotic cells. Membrane-bound ribosomes transfer proteins to the ER lumen for subcellular targeting or secretion. Passive diffusion is believed to be the predominant mechanism for protein transport in the ER. However, since the ER is a continuous network that undergoes major structural changes, we assess the structural dynamics as an additional mechanism to control transport of luminal proteins. MATERIALS AND METHODS: ER in COS-7 cells was visualized by spinning-disk optical microscopy using transfected mRFP-KDEL or mMaple-KDEL. We modified structural-dynamics through pharmacological treatments that alter cytoskeleton stability, molecular motors, and the energetic metabolism. Through analysis of fluorescence fluctuation, we formulate a dynamics index based on autocorrelation and computational simulations. Protein transport was examined by fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) and single molecule tracking (SMT), obtaining a diffusion coefficient (D). We evaluated variations in D after modifying the structural-dynamics of the ER network by different drugs. RESULTS: Measurements of D indicate that diffusion of luminal proteins in single tubules is slower than in larger regions (microns), and increased with the ER-dynamics, But does not change with network-structure or cell morphology. DISCUSSION: We propose that the ER-dynamics generated by local cytoskeletal modifications is an active transport mechanism which, in addition to passive diffusion, is involve in the transport of ER luminal proteins.

Contacto: jorgetoledoh@gmail.com
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Resumen:
In recent years, the use of optical microscopy and medical image processing has become increasingly relevant for research and medical practice. In vivo microscopy has contributed to the study of cellular structure and function with previously unattained resolution, setting a basis for a deeper understanding of diseases like Cancer, Alzheimer, or Parkinson. Common goals of computational methods for image processing in this context are the quantification of static or dynamic structures either at cellular level, like nuclei or membranes, or at tissue level. Typical analysis tasks are shape description, and tracking, whose combination leads to dynamics quantification. The new generation of high-throughput optical microscopy operating now in South America includes lightsheet microscopy, super resolution techniques such as PALM, STORM, and automated acquisition setups (tissue scanner, multi-well). These technologies generate large volumes of data with specific optical characteristics which make proper image processing methods critical for the efficient extraction of relevant information. In this talk, I will show current work of our lab in deploying storage and network technologies available to local researchers to promote cutting edge collaborative works at the intersection of Cell Biology, Microscopy, and Image Processing. Examples of these efforts are: large-scale cell tracking in development biology, neuron structure automated descriptions, subcellular protein and cytoskeleton dynamics quantification. Acknowledgement: MC Laboratory is funded by FONDECYT 11161033, CONICYT PIA ACT1402, ICM P09-015-F, CORFO, and DAAD (57220037 & 57168868).

Contacto: mauriciocerda@med.uchile.cl
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Resumen:
During fetal life many programming factors such as subnutrition are able to modify the intrauterine environment determining permanent changes in adult life. Concerning reproduction, growth factors such as glial cell derived neurotrophic factor (GDNF) emerge as a potential factor that could mediate these adjustments. GDNF is known to regulate the decisions of the cellular fate of the spermatogonial stem cells (SSC) through a paracrin regulation. It is not yet determined whether subnutrition during developmental windows periods modulates the expression of this factor. Therefore, the objective was to determine whether subnutrition during pregnancy (UNP), lactation (UNL) or pregnancy / lactation (UNPL) modify GDNF expression in the adult testis. Testicular rat’s samples were processed and immunohistochemical technique using rabbit polyclonal anti GNDF was performed. Immunostaining area and intensity of GDNF immunoexpression (%) were measured. In addition, frequency of stages of the seminiferous cycle was determined and correlated with GDNF immunoexpression. In all cases, significance were considered to be P <0.05. The percentage of immunostaining area and the intensity of GDNF immunostaining were higher in the UNP and UNL group compared to the control group (p <0.0001). Our results showed an overexpression of GNDF during stage VII and VIII. Normally, GDNF protein is secreted by Sertoli cells maximized between XIII-I of spermatogenic stage cycle, and decreasing towards stage VII. Previous studies in mice demonstrate that testes over expressing GDNF were infertile, and develop testicular tumors. A complex process, the spermiation occurs at the beginning of stage VII in the rat, and is completed towards the end of stage VIII. Consequently, we suggest that subnutrition during lactation, and pregnancy modified GDNF expression that disturb spermatogenesis, particularly at stages were spermiation occurs within seminiferous cycle in adult animal testes. In conclusion, subnutrition during key periods of development increased GDNF with deleterious consequences on spermatogenesis.

Contacto: gpedrana@gmail.com
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Resumen:
El neurodesarrollo y las células neurales son blancos preferenciales de la deficiencia de hierro (DH) y del alcohol. La DH es la condición nutricional más prevalente afectando fundamentalmente a mujeres en edad fértil y sus hijos desde la gestación hasta la adolescencia temprana. Por su parte, el consumo abusivo de alcohol es responsable del 1% de las enfermedades neonatales no atribuibles a causas genéticas y de casi el 6% de las muertes mundiales. La DH y el alcohol alteran irreversiblemente al sistema nervioso central. Sin embargo son poco conocidos sus efectos combinados sobre las células gliales que son determinantes para la perpetuación del daño al SNC. Nuestro grupo ha analizado los efectos de DH-alcohol exponiendo astrocitos corticales neonatales al quelante de hierro desferroxamina (DFO, 25 µM, 96 h) y a etanol (100 mM, 24 h) y luego co-cultivado con neuronas y oligodendrocitos. La coexistencia DFO-alcohol provocó una disminución significativa del potencial y la funcionalidad mitocondrial además de un descenso en los niveles de glutatión en astrocitos. Sin embargo, DFO-alcohol bloqueó el aumento de estrés oxidativo producido por alcohol y las alteraciones del citoesqueleto de actina ocasionadas por DFO. La sobrevida de neuronas hipocampales co-cultivadas sobre astrocitos DH-alcohol fue la menor de todas las condiciones (80% del control). DFO y DFO-alcohol disminuyeron la sobrevida de oligodendrocitos en igual porcentaje, pero DFO-alcohol afectó además la morfología de los oligodendrocitos supervivientes. Nuestros resultados muestran que la DH y el alcohol alteran el fenotipo astrocitario actuando sinérgicamente sobre algunas respuestas y antagonizando otras. Sin embargo, la co-existencia DH-alcohol en astrocitos tuvo la mayor repercusión negativa sobre la viabilidad de neuronas y oligodendrocitos, lo que podría explicar el agravamiento de los efectos negativos sobre la sinaptogénesis y la mielinización cuando coexisten ambas condiciones.

Contacto: solivera2011@gmail.com
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Resumen:
El análisis de células mediante microscopía óptica (MO) es utilizado en diversas áreas de enseñanza, diagnóstico e investigación. Durante años el análisis cuantitativo y cualitativo de células al MO se realizó manualmente pero actualmente es posible realizarlo mediante algoritmos programables manipulando grandes cantidades de datos en poco tiempo. En el 2016 se realizó una actividad de Extensión en el Liceo N2 de Minas, Lavalleja con el objetivo de aproximar a estudiantes de secundaria a las técnicas histológicas de rutina y al análisis microscópico de las células.En esta experiencia se observaron y analizaron frotis de sangre. La actividad tuvo muy buena recepción por parte de los participantes, sin embargo, los docentes manifestaron que la identificación manual de células al MO conlleva un tiempo considerable. Si bien actualmente existen programas comerciales que detectan automáticamente variedades celulares, estos son muy costosos y no se encuentran disponibles rutinariamente.En este trabajo proponemos validar variables cuantitativas y cualitativas de reconocimiento celular, a través de imágenes obtenidas con MO. Se utilizaron frotis de sangre teñidas con técnicas histológicas de rutina. Se utilizó un programa de acceso libre (FIJI). Las variables seleccionadas para reconocer las células fueron: forma, contraste, tamaño de núcleo y contraste del citoplasma de neutrófilos. Los resultados preliminares muestran que existen varias posibilidades que permiten contabilizar variedades celulares. Una herramienta del programa contabiliza múltiples tipos celulares de forma manual. Este procedimiento no difiere de los utilizados actualmente por lo que no implicaría un gran impacto. Otra herramienta semi automatizada que brinda FIJI son los Macros, que permitan el análisis de ¨partículas¨. El operador la programa y luego puede ser reproducida en diversas imágenes obteniendo resultados muy similares.Concluimos que esta segunda herramienta permitiría optimizar tiempos y estandarizar procesos, no solo dentro del área biológica sino también en otros campos de estudio.

Contacto: erikwini21@gmail.com
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Resumen:
Clásicamente, el comportamiento maternal en la rata, y en mamíferos en general, ha sido entendido como una conducta altamente estereotipada que se extingue gradualmente a lo largo del período posparto. Sin embargo, experimentos de nuestro laboratorio muestran que esta conducta es flexible y que se adapta a las necesidades cambiantes tanto de las crías como del ambiente. Exploramos esta flexibilidad a través de analizar el comportamiento maternal y sus bases neurales a lo largo del período posparto así como el de madres con camadas superpuestas –hembras que cuidan dos camadas de diferentes edades simultáneamente-. Encontramos que la motivación maternal hacia crías con diferentes grados de desarrollo difiere entre el posparto temprano y el tardío. En estos períodos detectamos diferencias en el grado de organización de las redes perineuronales –involucradas en mecanismos de plasticidad- en el área preóptica media, región clave para la expresión de la motivación y el comportamiento maternal. Por otra parte, en experimentos con hembras con camadas superpuestas encontramos que los factores endócrinos –el perfil hormonal de la gestación tardía y el parto- tienen mayor relevancia que  la experiencia para la expresión de la flexibilidad y adaptación maternal.

Contacto: natiuria@gmail.com
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Resumen:
A pesar de varias décadas de investigación, todavía se desconoce la causa que lleva a la muerte neuronal progresiva en la enfermedad neurodegenerativa humana Esclerosis Lateral Amiotrófica (ELA). Tampoco existen tratamientos efectivos para prevenir o curar esta patología. En la ELA, las motoneuronas superiores e inferiores constituyen la población neuronal afectada. Hasta recientemente, el foco principal de los estudios ha sido precisamente la población de neuronas degenerantes, sin considerar su entorno celular, incluyendo células gliales como astrocitos y microglia. En los últimos 10 años, se ha planteado la hipótesis que los astrocitos jueguen un papel importante en la patogenia de la misma, basados en la observación de que frente al daño, las neuronas mueren pero los astrocitos proliferan y adoptan variados fenotipos adaptativos para proteger y/o dañar a las neuronas. Las transformaciones fenotípicas de los astrocitos están ligadas a alteraciones en la función mitocondrial y un aumento en la capacidad proliferativa comportamiento que se conoce como efecto Warburg. Recientemente, nuestro grupo ha encontrado en roedores SOD^G93A utilizados como modelos animales de ELA, revertir este fenotipo mediante el tratamiento con el modulador metabólico dicloroacetato (DCA). Este tratamiento determinó una restauración de la actividad mitocondrial a nivel de la médula espinal, una disminución de la proliferación y neurotoxicidad de los astrocitos, un retraso en la muerte neuronal y persistencia de una mejor actividad motora en los animales. Nuestros proyectos actuales buscan: a) profundizar en los mecanismos de toxicidad de los astrocitos a las motoneuronas, analizando la población de sus vesículas extracelulares b) establecer si los mecanismos propuestos operan también en los humanos con ELA, identificando posibles marcadores biológicos de la progresión de la patología.

Contacto: pcassina@fmed.edu.uy
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Resumen:
El espermatozoide es una célula particular cuya función es  proporcionar el 50% del genoma nuclear que caracteriza un organismo diploide. Para esto, el espermatozoide pierde durante la espermiogénesis la mayoría de su citoplasma y organelas,  manteniendo solo las estructuras necesarias para la fecundación. Para que ocurra un normal desarrollo del embrión es crucial que los espermatozoides mantengan la integridad de su cromatina, membrana y un epigenoma, incluyendo algunos ARNs. Se ha establecido que el espermatozoide no solo contribuye con el ADN al desarrollo embrionario sino también con ARNs producidos durante la espermatogénesis y que regulan expresión génica temprana durante las primeras divisiones celulares. Precisamente, en los últimos años ha aumentado la evidencia  exhibiendo que los daños a la cromatina o ADN espermático pueden afectar negativamente la fertilidad y por ende el desarrollo embrionario, y que aunque es normal que en un eyaculado haya una proporción de espermatozoides con fragmentación del ADN, los individuos identificados como subfértiles o estériles generalmente tienen una proporción mayor de espermatozoides con ADN fragmentado que aquellos determinados como fértiles. Es por ello que las causas de la fragmentación del ADN  espermático y el daño a la cromatina, así como las técnicas para diagnosticarlas se ha convertido en un tema actual en medicina reproductiva. No obstante, a pesar del intenso interés clínico en la célula  espermática como un predictor de la fertilidad masculina, la calidad del ADN no se evalúa usualmente en un análisis rutinario de semen. Esto debido principalmente al hecho de que las tecnologías actuales para esta evaluación son logísticamente complejas y tecnológicamente sofisticadas. En esta presentación se mostrará una actualización en las causas de los daños al genoma y epigenoma espermático,  su efecto sobre la fertilización y cuáles son las principales técnicas para su evaluación, sus  ventajas y desventajas.

Contacto: meacosta@unal.edu.co
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Resumen:
Durante el desarrollo embrionario temprano ocurren grandes trasformaciones en el perfil epigenético (metilación global del DNA y modificaciones de las histonas), que determinan la expresión génica embrionaria. Durante los primeros clivajes, el DNA de origen paterno y materno son desmetilados de forma diferencial, para ser metilados de novo entre la etapa de mórula y blastocisto. Las múltiples modificaciones en las histonas contribuyen, a su vez al estado de “silenciamiento” o “actividad” de los genes. A pesar de su relevancia desde el punto de vista básico o aplicado, la epigenómica embrionaria aún se enfrenta a serias limitaciones. La primera de ellas, es la escasez de material que puede ser recuperado de embriones tempranos. En segundo lugar, está la variabilidad entre las células embrionarias, las cuales comienzan a diferenciarse para dar origen al trofectodermo y al embrioblasto. Pero la principal limitación es el hecho de que el cultivo in vitro de embriones es causante per se de alteraciones en las marcas epigenéticas. Usando pools de 5 embriones bovinos homogéneos, hemos obtenido suficiente DNA para estudiar el perfil global de metilación o el grado específico de metilación de genes particulares, mediante tratamiento con bisulfito de sodio seguido de High Resolution Melting HRM, o secuenciación masiva. Para evaluar la expresión génica, hemos evaluado RNA de pools de 3 embriones bovinos homogéneos mediante microarreglos, y PCR cuantitativa. Al comparar los resultados de embriones producidos in vitro con embriones en la misma etapa de desarrollo, obtenidos de vacas superovuladas e inseminadas, hemos encontrado diferencias significativas en el perfil de metilación del DNA, en la expresión génica y en las marcas de las histonas. Sin embargo, el modelo in vitro sigue siendo la mejor alternativa para estudiar la epigenética del desarrollo embrionario.

Contacto: nelida.rodriguez@unorte.edu.uy
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Resumen:
La yerba mate presenta un alto contenido en polifenoles de conocido efecto antioxidante. En Uruguay el 85 % de la población es consumidora de “mate” y actualmente se sabe que esta infusión posee polifenoles, vitaminas y cofactores que podrían interferir en procesos patológicos de óxido reducción. Hipótesis: Los fenoles en ciertas condiciones pueden cortar cascadas redox y disminuir lesiones de ADN con alto potencial letal  y mutagénico; además el control del ciclo celular y la reparación de lesiones podría modularse en presencia de fenoles por activación del producto del gen Mec1/hATR. Se analizaron los posibles efectos protectores frente a dos tipos de radiaciones (gamma y UVC) a nivel celular, ya que  ciertas longitudes de onda  pueden  inducir  cascadas de óxido reducción, retardos en el tiempo de generación  celular y lesiones a nivel genómico. Se utilizaron como modelo eucariote cepas de Saccharomyces cerevisiae en fase exponencial: normales y mutantes deficientes en MEC1 y en la regulación de la sintesis de la ribonucleotido-reductasa: SC7 Klys 2-3 , WT (MATa ade2-101 his3D200 ura3DNco lys2DBgl CAN1), sml1 (MATa ade2-101 his3D200 ura3DNco lys2DBgl CAN1 sml1D::Kan), sml1/mec1(MATa ade2-101 his3D 200 ura3 DNcolys2DBgl CAN1sml1D:: Kan mec1D::Hyg). Como agentes con capacidad protectora: infusión de yerba mate, liofilizado de infusión de yerba mate caracterizado (Dra. R. Filip), ácido cafeico, 1,5 dicafeoil quinico. Se observó aumento de la probabilidad de sobrevida, disminución de la mutagénesis inducida y protección genómica con disminución de  roturas dobles  de ADN frente al daño producido por los diferentes agentes físicos utilizados. Estos resultados indican la interferencia de uno o más componentes de la infusión sobre  sistemas  redox  e interacción con vías de control del ciclo celular y de  reparación del ADN ( hATR/Mec1). Agradecimientos: Canarias SA, ANII, CSIC, INDT

Contacto: nbracesco@gmail.com
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Resumen:
El proceso de transformación maligna y la tumorigénesis implican una sucesión de alteraciones celulares, entre ellas la inestabilidad genómica. Esta, al igual que la carcinogénesis, es multifactorial y se propone como un sello distintivo del cáncer. Se caracteriza por diversos cambios que incluyen la reducción de la eficacia de clonación, alteraciones cromosómicas,  formación de micronúcleos y aumento de la frecuencia mutagénica. Es más, la inestabilidad genómica es considerada como una fuerza motora de la tumorigénesis. Por tanto, la comprensiòn de los mecanismos subyacentes a la iniciación y perpetuación de la inestabilidad genómica permitirá profundizar en los mecanismos subyacentes a la carcinogénesis. Durante el metabolismo celular normal se genera estrés oxidativo endógeno que puede producir daños aislados y agrupados en el ADN. Mientras que los daños esporádicos presentan alta probabilidad de ser reparados eficientemente, los daños agrupados pueden originar eventos citotóxicos y mutagénicos persistentes y dar lugar a inestabilidad genómica. Basados en la hipótesis de la presencia de signaturas de daños de ADN únicos al fenotipo de inestabilidad genómica, determinamos el espectro de daños agrupados del ADN usando clones celulares derivados de células únicas de la línea celular humano-hamster GM10115 sobrevivientes a diferentes tipos de radiaciones. Se determinaron las frecuencias de roturas dobles, daños agrupados de bases oxidadas y de sitios abásicos en la línea celular parental y clones estables e inestables que presentan inestabilidad genómica radioinducida. Se observó que los niveles de daños totales de ADN fueron similares, sin embargo, cada clon inestable mostró un espectro de daños persistentes únicos. Se especula que este espectro característico se vincula con alteraciones en la señalización y reparación de los daños de ADN subyacentes a la perpetuación de la inestabilidad genómica.  Coautores: Lucia Kolodiuk (Stony Brook University, NY, USA), Janet E. Baulch (Department of Radiation Oncology, University of California, Irvine, CA, USA).

Contacto: dkeszen@gmail.com
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Resumen:
Una de las de propiedades físicas que puede cambiar en el microambiente de los axones es la rigidez de la matriz extracelular por donde transitan. Sin embargo, la influencia de la rigidez del sustrato sobre el crecimiento axonal es un campo que ha sido poco explorado. El colágeno-I, componente más abundante de la matriz extracelular, es ampliamente utilizado en ingeniería de tejidos para promover la regeneración de nervios periféricos. En este trabajo nos propusimos estudiar el efecto de la rigidez de matrices tridimensionales (3D) de colágeno-I sobre el crecimiento de los axones simpáticos, utilizando cultivos primarios de explantos de ganglio cervical superior de ratas postnatales. Los axones simpáticos fueron desafiados a crecer en un sustrato rígido generado por el tratamiento del colágeno con glicoaldheído (GA) y se evaluó su crecimiento por microscopía de fluorescencia a las 24 y 48 horas de cultivo. Los explantos crecidos en matrices-3D rígidas presentaron axones más cortos que en matrices controles. Esta inhibición del crecimiento axonal provocada por la rigidez se detecta tanto a las 24hs como a las 48hs. La morfología del cono de crecimiento de los axones (CC) también se vio afectada. A las 24hs, el 72% de los axones crecidos en matrices rígidas presentaba CCs colapsados, mientras que sólo un 40% de los CCs crecidos en matrices control mostraron esta morfología. A las 48hs, esta diferencia se acentuó aún más (CCs colapsados: 80% matrices-3D-rígidas vs 21% matrices-3D-control; p=0,0001). Estos resultados ponen de manifiesto la relevancia de la rigidez de las matrices de colágeno demostrando que los axones simpáticos enfrentados a un ambiente rígido crecen menos, a pesar de que este sea permisivo, viéndose afectado también el citoesqueleto de F-actina de la estructura axonal que sensa el ambiente.

Contacto: gabriela.vierci@gmail.com
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Resumen:
Los flavonoides se encuentran ampliamente distribuidos en el reino vegetal y poseen diversas actividades biológicas, entre ellas antioxidantes, antimicrobianas y anticancerígenas. Son componentes importantes en la dieta humana, aunque se consideran como no nutrientes. Se estima que la ingesta diaria de flavonoides oscila entre 50 y 1000 mg, dependiendo del consumo de vegetales y frutas, vino tinto y té, aunque esta cantidad puede ser superior en personas que suplementan sus dietas con flavonoides. Se ha sugerido que los flavonoides deben poseer una toxicidad mínima si son ingeridos en las cantidades de una dieta típica vegetariana. Está ampliamente aceptado que los radicales libres oxigenados, conocidos como especies reactivas de oxígeno (ERO) son causantes de envejecimiento y diversas enfermedades degenerativas (enfermedad cardíaca, cataratas, disfunción cognitiva, cáncer). Los humanos poseen sistemas antioxidantes endógenos que brindan cierta protección contra radicales libres oxigenados. Sin embargo, debido a la eficiencia incompleta de los sistemas endógenos de defensa y la abundancia de algunas situaciones fisiopatológicas en donde se producen ERO en exceso, se necesitan antioxidantes presentes en la dieta para disminuir los efectos acumulativos del daño oxidativo. Con respecto a esto, diversos flavonoles, entre ellos la quercetina poseen actividad antioxidante. En el marco de un proyecto relacionado con la síntesis y evaluación biologica de flavonoides nos hemos propuesto la sintesis de una serie de flavonoles derivados de la quercetina para su posterior evaluacion como antioxidantes. Se prepararon en cuatro etapas: protección de los hidroxilos fenólicos de los precursores, condensación aldólica para formar 2’-hidroxichalconas, ciclación oxidativa y remoción de los grupos protectores. Los compuestos fueron obtenidos con buenos rendimientos y caracterizados por RMN y EM. En una etapa posterior se determinará la actividad antioxidante en una etapa posterior por decoloración del radical difenilpicrilhidrazilo (DPPH) e inhibición de la peroxidación lipidica (TBARS).  

Contacto: DA.AYALA475@gmail.com
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Resumen:
El estímulo de succión provoca la eyección de leche (EL), un evento que se asocia al sueño de ondas lentas (SWS). La EL se puede medir indirectamente por la ganancia de peso de las crías (GPC), evento que no ocurre si las ratas madres se encuentran privadas de sueño. El Haloperidol (HAL) es un antagonista dopaminérgico que facilita la adopción de posturas de amamantamiento, la EL y la GPC en ratas madres, y promueve el SWS en ratas macho, un efecto que no ha sido determinado en hembras lactantes. Nuestro objetivo es determinar si el HAL promueve el SWS en ratas madres y si existe una correlación entre el SWS y la GPC. Se trataron ratas madres (n=6), previamente implantadas para registros polisomnográficos, con HAL (0.4 mg/kg, i.p.) o vehículo. El tratamiento se realizó tres horas después de la separación de la camada (cuatro machos, cuatro hembras) de la madre y una hora antes de su reunión, entre los días 6-8 postparto. Luego de su reunión, se realizaron registros de sueño-vigilia y se pesó el total de la camada inmediatamente antes y después de los registros. Los resultados preliminares muestran que las camadas de madres tratadas con HAL tienden a ganar más peso (9.1 ± 1.8 g) que las de madres control (5.5 ± 0.7 g, p=0.063). Además, el HAL incrementa el tiempo en SWS (127.5 ± 13.4 min) comparado con el vehículo (87.4 ± 4.7 min, p=0.029). Finalmente, el SWS tiene una tendencia a estar positivamente correlacionado con la GPC después del tratamiento con HAL (r=0.94, p=0.054). Estos resultados sugieren que el HAL podría facilitar la GPC, no solo por promover el amamantamiento, sino porque facilita el SWS.

Contacto: Flo.-21@hotmail.com
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Resumen:
La descarga del órgano eléctrico (DOE) de los peces eléctricos tiene una doble función: percibir el mundo circundante y comunicarse con sus coespecíficos. Estas dos funciones, al usar el mismo canal, interactúan y pueden generar interferencia. Los peces eléctricos desarrollaron un sofisticado comportamiento eléctrico para evitar la interferencia de DOEs de coespecíficos, la Respuesta de Evitación de Interferencia (JAR por sus siglas en inglés) que ha sido muy bien estudiada especialmente en peces de onda. Gymnotus omarorum es un pez eléctrico de pulso, solitario y altamente agresivo que presenta agresión territorial fuera del período reproductivo. En esta especie, al finalizar el encuentro agonístico, el dominante presenta mayor frecuencia que el subordinado, debido a que éste último baja su frecuencia como señal de sumisión eléctrica. Estudiamos la JAR cuantificando número de coincidencias entre las DOEs de ambos peces durante encuentros agonísticos en condiciones de libre movimiento, tomando muestras al azar de pocos segundos de duración antes y luego de resuelto el conflicto. Trabajos previos de nuestro grupo mostraron que la vasotocina, neuropéptido implicado en el comportamiento agonístico, afecta las señales eléctricas de sumisión de Gymnotus omarorum. Exploramos la acción de vasotocina y el antagonista del receptor de vasotocina Compuesto de Manning (MC) sobre la JAR. Resultados preliminares mostraron que después de un encuentro agonístico, la tasa de coincidencias de las DOEs es mayor para subordinados que para dominantes en condiciones control, y que este aumento en la tasa de coincidencias para los subordinados es revertido cuando se administra MC a los dominantes. Se diseñó un protocolo experimental que permite analizar las coincidencias de las DOEs de ambos peces en movimiento restringido, antes y después del encuentro agonístico, en condición control y con Vasotocina y MC, con el fin de validar los resultados preliminares mediante registros más estables y de mayor duración.

Contacto: rossanaperrone@gmail.com
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Resumen:
PBC es una droga de abuso que se comercializa generalmente adulterada y cuya vía de administración es la inhalación pulmonar. Su consumo crónico genera una fuerte dependencia, alteraciones fisiológicas/comportamentales y toxicidad. Se especula que la vía de administración podría explicar dicho perfil aunque hipotetizamos que la influencia de los adulterantes no debe ser desestimada. Datos forenses de la composición química actual de muestras incautadas de PBC no han sido reportados y la presencia de adulterantes y/o productos de su combustión en el humo inhalado por sus consumidores no ha sido comprobada. Mediante cromatografía gaseosa acoplada a espectrometría de masa (GC-MS) analizamos químicamente 306 muestras de PBC incautadas en 2014-2015,  donadas por el Instituto Técnico Forense (Uruguay). Además, determinamos la composición química de muestras de PBC volatilizadas, con y sin adulterar, así como la presencia de los adulterantes encontrados luego de su volatilización. La temperatura de volatilización de las muestras volatilizadas fue registrada mediante Termocupla. El 90% de las muestras analizadas estaban adulteradas. Fenacetina, cafeína y aminopirina aparecieron en un 76, 64 y 27 %, respectivamente. Un 54.2% de muestras estaban adulteradas con la combinación de cocaína, cafeína y fenacetina (30% por cada sustancia). Fenacetina y cafeína se volatilizaron a una temperatura promedio de 327 ºC y 290 ºC, respectivamente, y ambos espectros de masa demostraron su integridad química y la ausencia de productos de pirolisis. PBC adulterada con fenacetina o cafeína se volatilizó 285 y 220 ºC, respectivamente, y PBC no adulterada a 268 ºC. Anhidro-ecgonina-metilester, acido benzoico y carbometoxi-cicloheptatrienos aparecieron en ambos tipos de muestras de PBC volatilizadas. Nuestros datos reflejan lo consumido en el periodo analizado e indican que los adulterantes persisten en el humo sin descomponerse luego de su volatilización, sugiriendo que, en el consumo de PBC es relevante considerar su impacto en la salud humana. 

Contacto: cscorza@iibce.edu.uy
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Resumen:
La vía de señalización mediada por los factores Slit y sus receptores Robo regula una gran gama de procesos durante el desarrollo. Una de sus funciones mejor conocidas es como una señal repulsiva para el crecimiento axonal de las células ganglionares de la retina (CGRs), pero su rol en la polarización de estas células no ha sido estudiado adecuadamente. En este trabajo nos planteamos ampliar la caracterización funcional de esta vía de señalización durante la diferenciación de las CGRs en el pez cebra, concentrándonos en Slit2 y Robo2 como principales candidatos en estas células. El bloqueo de expresión de slit2 fue realizado haciendo uso del sistema CRISPR/Cas9. La mutación de este gen se da en forma de mosaico en la primera generación y, en estos embriones, no ocasiona defectos morfológicos externos notorios. El análisis mediante microscopía confocal revela errores de guía axonal de las CGRs tanto fuera como dentro del territorio retiniano, con una gran proporción de errores en el quiasma óptico y una menor cantidad de errores dentro de la retina. Este fenotipo es muy similar al observado en los embriones homocigotas mutantes de la segunda generación. El bloqueo del receptor  Robo2 por medio de una forma dominante negativa también produce errores de guía axonal dentro de la retina, pero más frecuentemente. En este caso, la cantidad de axones desviados es mayor, y los mismos no se extienden más allá de la capa plexiforme interna. En ambos casos, el crecimiento inicial de los axones hacia la lámina basal indica que la orientación neuronal ocurre correctamente. Nuestros resultados indican que tanto Slit2 como Robo2 median la inhibición del crecimiento axonal de las CGRs dentro de la retina en el pez cebra, pero no cumplen un rol esencial en la orientación neuronal, al menos de forma aislada.

Contacto: cdavison@pasteur.edu.uy
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Resumen:
El área preóptica media (mPOA) es crucial para la regulación del sueño y el comportamiento maternal. Esta área recibe proyecciones de las neuronas hipocretinérgicas, localizadas en el hipotálamo postero-lateral e involucradas en la promoción de la vigilia. Recientemente hemos demostrado que la hipocretina-1 (HCRT) en el mPOA facilita el comportamiento maternal. El objetivo de este estudio es describir la actividad eléctrica basal de neuronas del mPOA, su relación con las características del electroencefalograma (EEG) y su modulación por HCRT en ratas lactantes. Los registros extracelulares de neuronas en el mPOA se realizaron bajo anestesia con uretano. La microinyección yuxtacelular de HCRT se realizó por presión utilizando micropipetas dobles. Registramos 45 neuronas en el mPOA con las siguientes características electrofisiológicas: duración media del potencial de acción de 2,40 ± 0,09 ms, frecuencia de descarga basal de 5,98 ± 0,98 Hz (rango: 0,27 - 28,29) y coeficiente de variación de 0,77 ± 0,09. Encontramos 12 neuronas con actividad relacionada al EEG, de las cuales 10 aumentaron su actividad durante la desincronización del EEG (“DES-ON”) y dos lo hicieron durante la fase sincronizada (“SIN-ON”). De 19 neuronas inyectadas, la HCRT disminuyó la frecuencia de descarga en 10 neuronas de 4,30 ± 0,65 a 2,76 ± 0,47 Hz, aumentó en siete neuronas de 3,05 ± 0,53 a 5,90 ± 0,97 Hz y en dos no tuvo efecto. De las neuronas inyectadas tres se relacionaron con el EEG, dos del tipo “SIN-ON” disminuyeron su frecuencia con HCRT y una neurona “DES-ON” aumentó su frecuencia con HCRT. Nuestros datos preliminares muestran una población neuronal electrofisiológicamente heterogénea en el mPOA de ratas posparto y que los efectos de la HCRT variaron según el tipo de neurona sugiriendo una función promotora de vigilia en las neuronas relacionadas con el EEG.

Contacto: rivas.mayda@gmail.com
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Resumen:
La sintomatología positiva o psicótica es una de las alteraciones más graves de la esquizofrenia. Se han reportado disfunciones en el circuito cortico-talámico-cortical aunque es necesario estudiar la participación específica de las diferentes áreas y sus proyecciones. Mediante el uso del modelo farmacológico de esquizofrenia del antagonismo de receptores N-metil-D-aspartato (NMDA), hemos reportado que el núcleo anterior del tálamo (ATn) es un sustrato clave en la acción sistémica del antagonista NMDA, MK-801, para la inducción de comportamientos tipo-psicotomiméticos. Además, demostramos que un mecanismo de desinhibición GABAérgica del ATn subyacería al efecto comportamental, sugiriendo que existe un balance excitatorio/inhibitorio alterado vía desinhibición de inputs GABAérgicos del núcleo reticular del tálamo, nRT  hacia neuronas del nAT (principal input GABAérgico) generando una excitación en sus principales regiones de proyección: corteza retrosplenial (RSC) e Hipocampo (Hc). En este trabajo imitamos la desinhibición GABAérgica del ATn, mediante la microinfusión bilateral de bicuculina (antagonista GABA_A; 100 ng/0.2ml/min) en ratas canuladas e investigamos la expresión de Fra-2 (marcador de actividad neuronal) por inmunohistoquímica en la RSC (rostral y caudal) e Hc (giro dentado, GD; CA1 y subículo). Evaluamos las conductas tipo-psicotomiméticas (software Ethovision XT) y los resultados se compararon con los efectos inducidos por la administración sistémica intraperitoneal (i.p.) de MK-801 (0.2 mg/kg) o salino (control). A diferencia de lo observado para MK-801, los comportamientos tipo-psicotomiméticos fueron parcialmente inducidos por bicuculina intra-ATn sugiriendo que el bloqueo GABA_A intra-ATn no modela completamente la acción sistémica de MK-801. Bicuculina intra-ATn no modificó el número de células Fra-2 positivas en la RSC rostral y caudal vs. salino intra-ATn (control), mientras que únicamente lo aumentó significativamente en el GD. MK-801 tendió a aumentar levemente la expresión de Fra-2 en RSC y en GD. Nuestros resultados colaboran en la comprensión de la neurobiología que subyace a la sintomatología positiva de la esquizofrenia.  

Contacto: ximelopezhill@hotmail.com
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Resumen:
En los mamíferos, el periparto representa un importante período de plasticidad comportamental. Si bien en la literatura existe información acerca de cambios estructurales plásticos en el sistema nervioso (SN) en ratas lactantes, ésta se centra principalmente en estructuras hipocampales y en momentos puntuales (inicio de la lactancia). Las redes perineuronales (PNNs) constituyen un tipo de matriz extracelular especializada formada principalmente por proteoglicanos que rodea muchos somas, dendritas proximales y los segmentos iniciales de algunos axones del SN central, conformando una estructura tipo red con “agujeros” en los sitios de contacto sináptico. Su formación es detectada relativamente tarde en el desarrollo cuando el circuito sináptico del SNC se establece y madura. Si bien se postula a la maternidad como un período de gran plasticidad, se desconoce cómo es la expresión de las PNNs durante este período. El objetivo de este estudio fue investigar la estructura de las PNNs en regiones del SNC del circuito maternal en ratas madres a lo largo del posparto. Así, se evaluaron los siguientes grupos experimentales: 1) Hembras primíparas en posparto temprano (día 2), 2) Hembras primíparas en posparto tardío (día 22) y 3) Hembras ciclantes en diestro. Encontramos que la estructura de las PNNs difiere entre ratas vírgenes y lactantes en el período posparto temprano a nivel del área preóptica media (mPOA). La marca para glucosaminoglicanos obtenida mediante la utilización de la lectina de Wisteria Floribunda es difusa y tenue en las hembras vírgenes en diestro mientras que observamos redes claramente definidas en el día 2 posparto. De forma interesante, hacia el final del período posparto, esta estructura muestra un perfil similar al de las hembras ciclantes. Estas diferencias podrían estar asociadas a cambios en los niveles de plasticidad del mPOA subyacentes a la dinámica de la expresión del CM a lo largo del posparto.  

Contacto: marcelaferreno@gmail.com
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Resumen:
Poco se sabe sobre la epidemiología del consumo de alcohol en jóvenes uruguayos, y menos sobre los factores que promueven este consumo. El malestar psicológico, una sensación subjetiva de alto nivel de estrés, desmoralización, discomfort o desasosiego, facilita la emergencia de enfermedades mentales, incluidos los trastornos por consumo de sustancias. Este trabajo analizó, en una muestra de 1527 jóvenes uruguayos de 18 a 30 años (74% mujeres), la relación entre malestar psicológico y consumo de alcohol. Esta franja etaria es la de mayor prevalencia de abuso y dependencia al alcohol. Los participantes completaron una encuesta online que incluía instrumentos para medir malestar psicológico (Kessler), patrón perjudicial de consumo de alcohol (AUDIT) y consecuencias negativas derivadas del uso de alcohol (YAACQ). Se observó una correlación significativa entre malestar psicológico y los puntajes de AUDIT y YAACQ. Estos resultados sugieren que el malestar psicológico aumenta la vulnerabilidad al abuso y consecuencias negativas del alcohol.

Contacto: paulruiz@psico.edu.uy
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Resumen:
En mamíferos se distinguen tres estados comportamentales: vigilia, sueño lento y sueño REM (sREM). La vigilia se caracteriza por ondas eléctricas de baja amplitud y alta frecuencia del electroencefalograma (EEG). El sueño lento presenta ritmos eléctricos lentos y de mayor amplitud donde la actividad cognitiva es prácticamente nula. El sREM o "paradójico" en cambio, se caracteriza por una actividad de mayor frecuencia y menor amplitud similar a la vigilia, existiendo una completa pérdida del tono muscular; en esta etapa es donde principalmente ocurren los sueños (actividad onírica). A las oscilaciones del EEG que se observan en el rango de frecuencia de 30 a 100 Hz se le denomina actividad u oscilaciones gamma. Las oscilaciones gamma se encuentran fuertemente vinculadas a las funciones cognitivas e incluso se postula que la coherencia gamma entre áreas distantes de la corteza es un correlato neural de la percepción unificada y consiente. Utilizando los análisis de potencia y coherencia espectral electroencefalográfica entre áreas cerebrales, como índices de sincronización local y de largo rango, respectivamente; mostramos en 3 modelos animales (gato, rata y ratón) que, durante el sREM, a pesar de presentar actividad gamma local similar a la vigilia, existe un desacople entre sitios neocorticales distantes a esta frecuencia.Conclusión. Durante el sREM, a pesar de tener un EEG localmente activado, existe un desacople de la actividad gamma de frecuencias entre áreas de la neocorteza. Por tanto, las interacciones funcionales entre áreas corticales distantes, que son fundamentales para las funciones cognitivas, son diferentes durante la vigilia y el sREM. Dado que este acoplamiento y desacoplamiento de corto y largo alcance entre áreas corticales, en la banda gamma de frecuencias, se observan en felinos, roedores y también en humanos, consideramos que este es un rasgo característico y conservado del sREM en mamíferos.

Contacto: mat.cavelli@gmail.com
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