Resumen:
Los camélidos además de los anticuerpos convencionales producen anticuerpos carentes de cadena liviana (sdAbs) en los que el sitio de unión al antígeno está formado únicamente por el dominio variable de 15 kDa de la cadena pesada (VHH). Debido a la ausencia de ”barajado” de las cadenas livianas y pesadas, el aislamiento de VHHs a partir de bibliotecas de expresión en fagos es más sencilla que en el caso de anticuerpos convencionales. Por otro lado, los VHHs se expresan con alto rendimiento en forma recombinante (nanobodies), tienen propiedades únicas de solubilidad y estabilidad, y constituyen versátiles dominios de especificidad para la construcción de quimeras, o chaperones para cristalización de proteínas. Con solo 3 CDRs la diversidad estructural del sitio de unión es menor que en los anticuerpos convencionales, pero esto no parece limitar su capacidad de reconocimiento y se han aislado nanobodies de alta afinidad contra todo tipo de antígenos. Una excepción parcial a lo anterior es el caso de las moléculas pequeñas (haptenos), que típicamente se unen a cavidades formadas en la interface de las cadenas livianas y pesadas en los anticuerpos convencionales. En esta presentación discutiremos estas propiedades de los nanobodies con ejemplos de aplicaciones llevadas adelante por nuestro grupo.

Contacto: ggonzal@fq.edu.uy
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Resumen:
La activación de receptores acoplados a la proteína G (GPCRs) resulta en la generación de  segundos mensajeros como AMP cíclico (AMPc) y GMP cíclico (GMPc). Esto promueve una cascada de eventos pleiotrópicos a nivel intracelulares cuyo resultado final depende de la adecuada compartimentalización de las señales dando lugar a circuitos funcionales de información. En dicho contexto, conocer la correcta discriminación espacio-temporal versus la distribución global de estos segundos mensajeros permitiría aumentar la especificidad de potenciales fármacos y reducir sus efectos adversos. Para ello es imprescindible entender la organización estructural que determina la función y regulación de los compartimientos individuales de cada segundo mensajero. Disecar estas vías de señalización requiere de procedimientos no invasivos y en tiempo real en células o tejido vivo. Por estos motivos, frecuentemente se emplean técnicas espectroscópicas para monitorear el cambio de fluorescencia por efecto FRET de sensores moleculares.Estos sensores están típicamente constituido por un modulo proteico capaz de ligar AMPc/GMPc generando una transición alostérica y una pareja de variantes espectrales de la proteína fluorescente verde (GFP) que cambian su orientación y distancia relativa como resultado del mecanismo alostérico. Usando una estrategia racional que combina bioinformática, modelado molecular, simulaciones de grano grueso, biología molecular y experimentos de fluorescencia, hemos desarrollado una nueva generación de sensores FRET (llamado CUTie) con una arquitectura innovadora, formada por dos módulos fluorescentes anidados en un dominio de plegamiento mínimo de unión al ligando que deja el extremo N-teminal libre para la fusión a otra proteína. CUTie permite detectar concentraciones de nucleótidos cíclicos intracelulares con una resolución sin precedentes, gran selectividad e independencia de sensibilidad al compartimiento que sea dirigido. Este avance tecnológico abre el campo de posibilidades para la ingeniería de nuevos sensores con distintas afinidades y potencial multifunción al poder acoplar diferentes módulos efectores a una sola molécula.

Contacto: fklein@pasteur.edu.uy
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Resumen:
La enfermedad de von Hippel-Lindau (VHL) es un desorden hereditario, autosómico dominante que predispone a la formación de una variedad de quistes y tumores benignos y malignos en diversos órganos. El gen de VHL es un supresor tumoral que codifica para una proteína (pVHL) la cual, integrada al complejo multiproteico VBC, determina la poliubiquitinación y posterior degradación por el proteasoma de las subunidades α del factor inducible por hipoxia (HIFα). Si bien en los últimos años se han descripto otras funciones de pVHL independientes de HIF y relevantes para el desarrollo tumoral, la regulación del nivel de subunidades HIFα sigue siendo su función mejor caracterizada.Tras demostrar mediante ensayos in vivo la patogenicidad de dos variantes de pVHL (P138R y L163R) caracterizadas por nuestro grupo se buscó analizar in silico su estructura y dinámica para contribuir al conocimiento de los mecanismos moleculares subyacentes. Se emplearon herramientas de modelado computacional (campo de fuerza clásico AMBER) para predecir estructura e interacciones proteína-proteína y proteína-solvente en complejos VBC-HIF (PDBID 1LQB) de cada variante P138R/L163R comparada a pVHL nativa bajo condiciones quasi-fisiológicas (caja de agua explícita TIP3P y contraiones, NPT a 310 K y 1 atm). La termodinámica de la interacción VBC-HIF fue también caracterizada usando la aproximación MM/PB(GB)SA.La estabilidad relativa de los complejos VBC-HIF formados con ambas variantes resultó ser menor que con pVHL nativa. Aun así, estos complejos se forman in vitro. Analizada la accesibilidad de Lys blanco de modificaciones postraduccionales determinantes de la estabilidad y funciones HIF independientes de pVHL, se detectaron diferencias que deben ser confirmadas in vitro. Los resultados obtenidos, sientan base para futuros estudios tendientes a determinar la implicancia de las modificaciones estructurales aquí caracterizadas in silico en los procesos de degradación y modificación de pVHL.

Contacto: cmatho@fcien.edu.uy
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Resumen:
HemR, de Leptospira, es un regulador de respuesta de la familia de proteínas OmpR/PhoB y controla el metabolismo del hemo, esencial para estas bacterias. Tras su activación por fosforilación, mediada por la histidin-quinasa HemK, HemR actúa como un regulador transcripcional dual: induce la expresión de genes codificantes para enzimas involucradas en la síntesis de hemo, e.g. el operón hemA, probablemente reclutando a la ARN polimerasa (ARNP); y simultáneamente reprime la expresión de proteínas catabólicas de degradación de hemo, e.g. el operón hmuO, impidiendo estéricamente la asociación de la ARNP al promotor. El operón hmuO (o hol) codifica entre otras para la hemo oxigenasa, un factor de virulencia en Leptospira patógenas. El objetivo de este trabajo consiste en desacoplar la regulación dual de HemR mediante mutagénesis dirigida en su bucle de transactivación, permitiendo su unión al ADN pero impidiendo el reclutamiento de ARNP. Los residuos mutados fueron seleccionados en base a alineamientos secuenciales y estructurales entre HemR y PhoB, y análisis estructurales de los complejos PhoB:ADN y ARNP:ADN, siguiendo una estrategia de diseño racional. Las variantes de HemR se expresaron en Escherichia coli y se purificaron por cromatografía de afinidad y exclusión molecular. La unión de los mutantes a los promotores hemA y hmuO fue confirmada por ensayos de retardo de movilidad electroforética. Inesperadamente, algunos mutantes se unieron al ADN incluso desfosforilados. Estos constructos mutados están siendo clonados junto a su promotor nativo en un vector “shuttle” para conjugar desde E. coli en una cepa knockout hemR^- de Leptospira biflexa. La expresión de los promotores será determinada por RT-PCR. Este trabajo contribuye a entender los mecanismos moleculares que aseguran la conexión estímulo-respuesta en el metabolismo del hemo, íntimamente ligado a la patogenicidad de Leptospira.  

Contacto: juanimelio@pasteur.edu.uy
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Resumen:
Las Ciencias de la Vida están viviendo una nueva revolución: poder ir desde la observación de detalles moleculares y sus interacciones, hasta su integración en mecanismos funcionales de organismos vivos. La Biología Estructural ha contribuido con estructuras 3D y propiedades bioquímicas de una enorme diversidad de moléculas biológicas. Hoy caminamos hacia enfoques sistémicos, integrando escalas temporales y espaciales de mayor magnitud. En este trabajo discutiré ejemplos de nuestro laboratorio, combinando aproximaciones complementarias para estudiar motilidad en bacterias.  La motilidad es esencial en quimiotaxis, nutrición, y también en la diseminación de bacterias patógenas. Elegimos el género Leptospira como modelo singular de locomoción. Estas Espiroquetas poseen sólo dos flagelos, determinantes de la morfología celular y de su capacidad de natación. En contraste con sistemas ampliamente estudiados, los flagelos de Leptospira no son extracelulares, sino que rotan confinados en el espacio periplásmico. Nuestros resultados revelan que la composición proteica del flagelo de Leptospira es inusualmente compleja. Centrando nuestro análisis en el filamento (prolongación que sobresale del motor y el gancho conector), además de la flagelina, hemos identificado varias proteínas adicionales. Las “flagellar coiling proteins” Fcp A y B [1], esenciales para la motilidad traslacional, y para la virulencia de especies patógenas. También se reclutan dos isoformas de FlaA, conservadas en todas las Espiroquetas. Resolvimos las estructuras cristalográficas de FcpA [2] y FcpB, que sorprendentemente revelan dos nuevos plegamientos proteicos, ausentes en la PDB. Estamos obteniendo mapas de densidad 3D por crio-tomografía electrónica de filamentos enteros de Leptospira, en los cuales podremos ajustar las estructuras cristalográficas. El filamento flagelar de Leptospira parece ser un ensamblaje supramolecular con marcada asimetría, lo que nos conduce a hipótesis nuevas sobre el mecanismo de natación de Espiroquetas.   [1] Wunder, Mol Microbiol (2016) 101:457-70. [2] San Martín, Acta Crystallogr F (2017) 73:123-9.

Contacto: alebus@pasteur.edu.uy
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Resumen:
Mosquitoes transmit a broad range of human diseases caused by viruses and protozoans, including dengue, chikungunya, zika and malaria. Immune signaling pathways have recently been shown to regulate anti-dengue and anti-Plasmodium immunity in mosquitoes. The three major immune signaling pathways (Toll, IMD, and JAK-STAT) that were originally described in Drosophila or mammals have been identified in Aedes aegypti and Anopheles gambiae. The Ae. aegypti JAK-STAT pathway has been shown to be an important component of the human anti-dengue responses, while the An. gambiae IMD pathway is a key pathway in anti-Plasmodium defenses. Immune enhanced mosquitoes have recently been generated by genetic engineering. Particularly, overexpression of Rel2, a positive regulator of the IMD pathway, renders Anopheles mosquitoes more resistant to Plasmodium. The same phenomenon is observed in Ae. aegypti infected with dengue virus when Dome, a positive regulator of the JAK-STAT pathway, is overexpressed. We are currently using CRISPR-Cas9 to generate specific knock out and knock in genetically modified mosquitoes to evaluate the antiviral potential of a set of DENV-modulated genes, newly identified in our laboratory through RNA-seq assays.  

Contacto: jaysneto@gmail.com
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Resumen:
Gene editing via CRISPR/Cas9 has prompted a recent revolution in molecular biology by enabling the fast, ease and low cost precise manipulation of genes and genomes. Here we will present some recent variations of this technology, which add new instruments into CRISPR/Cas9 toolbox: (i) regulation of gene expression, (ii) mutagenic chain reaction (MCR), (iii) base editing without DNA cleavage, (iv) heterologous expression of Cas9, (v) the use of ribonucleoproteins (RNPs), (vi) RNA tracking/cleavage and (vii) new nucleases (Cpf1, shorter Cas9 and high fidelity enzymes).      

Contacto: tiagocampospereira@ffclrp.usp.br
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Resumen:
Spats1 es un gen identificado previamente en nuestro laboratorio en la rata (Rattus norvegicus), de expresión específica del testículo y expresado diferencialmente durante el desarrollo testicular. En la primera onda espermatogénica, se expresa preferentemente en las células meióticas masculinas (Capoano et al., Gene Expr Patterns, 2010). La importante conservación evolutiva de este gen (desde cnidarios hasta humanos) sugiere la importancia de su función. Con el objeto de contribuir a la elucidación de la función de SPATS1 en relación con el desarrollo testicular y la espermatogénesis, generamos ratones knockout (KO) para el gen Spats1 mediante dos metodologías en paralelo: microinyección de células madre embrionarias genéticamente modificadas en embriones, y microinyección de CRISPR/Cas9 en cigotos. La realización de ambos abordajes para un mismo gen nos permitió comparar en términos cuantitativos la eficiencia de la aplicación de ambas metodologías en nuestro medio. En tanto la tecnología de células madre resultó de alta complejidad debido a la necesidad de cultivar células extremadamente delicadas y la imposibilidad de lograr transmisión del transgén a la línea germinal, la metodología CRISPR representó una enorme ventaja tanto en términos económicos como de rapidez, permitiéndonos generar los primeros ratones KO producidos enteramente en el Uruguay. La caracterización completa del fenotipo mutante incluyó análisis morfológicos, histológicos, moleculares y funcionales. Si bien evidencias recientes apuntan a la implicancia de SPATS1 en la fertilidad de los mamíferos, el fenotipo sutil encontrado en los ratones KO es consistente con resultados recientemente observados para otros genes vinculados a gametogénesis, que sugieren la existencia de redundancias que salvaguarden las funciones esenciales para la reproducción.

Contacto: adriana.geisinger@gmail.com
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Resumen:
Identificación de interactores in vivo de la proteína FhaA en micobacterias Mycobacterium tuberculosis, el agente etiológicos de la tuberculosis, es la segunda causa de muerte por un agente infeccioso a nivel mundial. PknG, una Ser/Thr-quinasa de proteínas, es un factor crucial  para la sobrevida de esta bacteria en el hospedero. Con el fin de elucidar las vías de señalización medidas por PknG, recientemente estudiamos su interactoma e identificamos nuevos sustratos de esta quinasa (1). En el presente trabajo caracterizamos uno de estos nuevo sustratos, la proteína FhaA, que contiene un dominio de reconocimiento de treoninas fosforiladas. Nos propusimos lacaracterización a nivel molecular de los complejos de señalización formados in vivo por FhaA, así como sus cambios dinámicos frente a diferentes estímulos que simulen el ambiente del hospedero. La estrategia experimental utilizada se basa en la sobre-expresión de FhaA conteniendo una etiqueta (Strep-tag) en M. smegmatis en combinación con el entrecruzamiento in vivo, purificación por afinidad y espectrometría de masa para obtener una instantánea de los complejos de señalización.  Nuestros resultados nos permitieron identificar una lista de 114 interactores directos o indirectos de FhaA, que incluye el único interactor previamente reportado (2). Con el fin de evaluar la contribución de residuos fosforilados en FhaA a las interacciones descritas, nos proponemos estudiar el interactoma de mutantes puntuales de FhaA en los residuos fosforilables. Finalmente obtuvimos el interactoma de FhaA cuando la micobacteria esta sometida a condiciones de hipoxia. La comparación de estos proteomas nos permitirá evaluar el rol de esta proteína en la adaptación al ambiente del hospedero.  (1) Gil, M. et al. Submitido JBC, Abril 2017.  (2) Roumestand, C. et al. Structure 2011, Structure 19:1525-1534.

Contacto: brivera@pasteur.edu.uy
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Resumen:
Las selenoproteínas contienen el elemento traza selenio como selenocisteína, 21er aminoácido, incorporado co-traduccionalmente a la cadena polipeptídica en un codón UGA. En ellas, la selenocisteína normalmente funciona como un eficiente catalizador redox. Del relevamiento previo surge que los tripanosomátidos portan un juego completo de genes para la maquinaria de biosíntesis de selenocisteína y su incorporación a tres selenoproteínas: SelK, SelT y Seltryp, siendo esta última parásito-específica. En este trabajo se estudió el selenoproteoma de especies de Kinetoplástidos en genomas recientemente secuenciados y se evaluó la relevancia in vivo de las selenoproteínas para los tripanosomas africanos. La búsqueda en bases de datos reveló que los genes para SelK, SelT y Seltryp están presentes en la mayoría de los Kinetoplástidos, incluyendo la especie de vida libre Bodo saltans, y que el de Seltryp se perdió en el subgénero Viannia de Leishmania. La homología y sintenia con persulfuro dioxigenasas y sulfotransferasas bacterianas sugieren un rol para Seltryp en el metabolismo del azufre. Una línea de Trypanosoma brucei knockout para la selenocisteína sintasa (SepSecS), incapaz de sintetizar selenocisteína, mostró una sensibilidad similar a la línea salvaje parental frente al estrés oxidativo inducido por exposición breve a altas concentraciones de metilglioxal o H₂O₂. Cabe destacar que la infectividad de la línea knockout, evaluada en un modelo de infección murino, no se vio afectada y no se detectaron aumentos en la expresión de proteínas involucradas en el metabolismo redox dependiente de tioles que expliquen efectos compensatorios. En suma, nuestros datos muestran que la supervivencia de los tripanosomas africanos en su hospedador mamífero no depende de la presencia de selenoproteínas y descartan que las mismas tengan un rol en su defensa antioxidante y/o virulencia. Sobre esta base, la idea de que las selenoproteínas puedan ser candidatos a blancos de fármacos para los tripanosomas africanos debe abandonarse.

Contacto: mbonilla@pasteur.edu.uy
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Resumen:
Las peroxirredoxinas (Prxs) son peroxidasas dependientes de tioles altamente ubicuas. La primera parte del ciclo catalítico consiste en la reducción del sustrato oxidante (hidroperóxido o peroxinitrito) al reaccionar con el tiolato (RS^-) de la cisteína peroxidática (C_P) que resulta oxidado a ácido sulfénico (RSOH). La reducción del RSOH a tiol en la segunda parte del ciclo depende de la Prx particular. La alquilhidroperóxido reductasa E (AhpE) de Mycobacterium tuberculosis tiene una única cisteína cuyo RSOH se reduce por micotiol/micorredoxina-1. M. tuberculosis está expuesto a sulfuro de hidrógeno (H₂S/HS^-) endógeno o formado por las células huésped, y se ha sugerido que podría modular su patogenicidad. Una de las formas como el H₂S/HS^- ejerce efectos biológicos es la modificación de cisteínas formando persulfuros proteicos (RSSH). En este trabajo mostramos que la reacción de AhpE-SOH con H₂S/HS^- equimolecular conduce a la formación de AhpE-SSH detectable por espectrometría de masa. Para caracterizar cinéticamente esta reacción se realizaron ensayos de competencia aprovechando 1) el cambio de fluorescencia intrínseco de la enzima que ocurre durante la sobreoxidación del AhpE-SOH (formación de AhpE-SO₂^-) al reaccionar con hidroperóxido en exceso y 2) el cambio de absorbancia que ocurre al reaccionar 5-tio-2-nitrobenzoato (TNB-S^-) con AhpE-SOH formando un disulfuro mixto (AhpE-SS-TNB). Ambos procesos resultaron inhibidos en presencia de H₂S/HS^-. Del análisis cinético surge una constante de formación de AhpE-SSH del orden de ~ 10³ M^-1s^-1 a pH 7.4 y 25ºC, cinco veces mayor que las reportadas para la persulfuración de albúmina humana o micotiolación de AhpE. Además, H₂S/HS^- podría ser un sustrato reductor alternativo al micotiol/micorredoxina-1, ya que se observó consumo catalítico del mismo en presencia de hidroperóxido y AhpE. La cinética del proceso está siendo caracterizada.

Contacto: marceloreyes26@gmai.com
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Resumen:
La aterosclerosis es una patología ampliamente distribuida en las sociedades occidentales, siendo las complicaciones de dicha enfermedad la causa número uno de muerte en nuestro país. En este contexto, nuestro grupo de investigación viene trabajando de forma activa en el desarrollo de potenciales fármacos para el tratamiento de enfermedades cardiovasculares y del metabolismo. En ese sentido hemos obtenido resultados muy promisorios con compuestos análogos de alfa-tocoferol, al que se adiciona un grupo funcional nitroalquenilo, para el tratamiento de enfermedades cardiovasculares. Por lo tanto, en la actualidad continuamos con el desarrollo eficiente de nuevos compuestos híbridos tocoferol-nitroalqueno. En este nuevo siglo, uno de los mayores desafíos de la química orgánica y de la química médica es la obtención de nuevos compuestos orgánicos estructuralmente diversos, de manera rápida, segura y eficiente, para estudiar sistemas biológicos y acelerar el proceso de descubrimiento de potenciales fármacos. Así, utilizamos como enfoque metodológico la síntesis orientada a la diversidad, a través de reacciones multicomponente, una de las estrategias sintéticas más prometedoras para la generación de una colección de moléculas pequeñas, ya que se obtienen nuevos compuestos con la diversidad estructural deseada en un paso de reacción con un mínimo de esfuerzo sintético, tiempo y formación de productos secundarios. En este trabajo se presentarán estudios iniciales utilizando las reacciones de Passerini (3 componentes, síntesis de alfa-aciloxiamida) y de Ugi (4 componentes, síntesis de alfa-bisamida) bajo condiciones de Química Verde, las cuales permiten incorporar los farmacóforos alfa-Tocoferol y nitroalquenilo de forma directa en un solo paso de reacción. Con este fin, se prueban diferentes condiciones para llevar a cabo estas reacciones, por ejemplo, utilizando agua como disolvente verde o condición libre de disolvente, tanto a temperatura ambiente como asistidas con microondas o ultrasonido como fuentes de calentamiento eficiente.  

Contacto: lucia.ines.colella@gmail.com
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Resumen:
La exposición excesiva a los rayos UV ocasiona diversos daños al organismo, entre ellos, quemaduras, fotoenvejecimiento y cáncer de piel. Existen diversos tipos de filtros solares aprobados para su uso sobre humanos. Los filtros UV actualmente autorizados se clasifican en dos tipos: inorgánicos y orgánicos. Dentro del primer grupo se encuentran el ZnO y TiO₂. Los filtros orgánicos se clasifican segun su estructura en ésteres, benzofenonas, dibenzoilmetanos, derivados del alcanfor, bencimidazoles y triazinas.  Algunos de los filtros solares utilizados actualmente poseen diversos efectos tóxicos sobre la piel o por absorción percutánea. Por ejemplo, la avobenzona es muy utilizada como filtro UVA pero no es fotoestable. Su irradiación causa fragmentación y  formación de arilglioxales y bencilos los cuales son sensibilizantes y citotóxicos. Otro problema importante es el relacionado con la contaminación ambiental. Los filtros solares se formulan para resistir el baño, sin embargo se estima que luego de 20 minutos de inmersión, el 25% de los ingredientes se liberan en el agua. Debido a la creciente demanda de filtros solares, es de gran importancia el descubrimiento de nuevos compuestos, más seguros y efectivos. Como continuación de una línea de investigación relacionada con la síntesis de filtros solares, en este trabajo se describe la preparacion de una serie de híbridos dibenzoilmetano-ácido cinámico, de estructura general Ph_A-CO-CH₂-CO-CH=CH-Ph_B donde Ph_A y Ph_B representan grupos fenilo; algunos de ellos no descritos aún en la literatura. Los compuestos se prepararon por tratamiento de 2’-hidroxiacetofenona con un cloruro de ácido para formar el correspondiente éster el cual luego fue sometido a un rearreglo de Baker-Venkataraman. Los compuestos fueron obtenidos con buenos rendimientos y caracterizados espectroscópicamente y posteriormente serán sometidos a estudios de fotodegradación.

Contacto: gjsagrera@gmail.com
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Resumen:
                Este trabajo tiene como objetivo principal la evaluación de derivados del Trolox™ (análogo hidrosoluble de la Vitamina E) como potenciales fármacos antiinflamatorios para la prevención/tratamiento de enfermedades cardiovasculares. El síndrome metabólico juega un rol fundamental en la patogénesis de estas enfermedades y se caracteriza por obesidad central, aumento de la glicemia y resistencia a la insulina, hipertensión arterial y dislipemia. En la base etiopatogénica de este síndrome, juega un rol central la obesidad patológica, caracterizada por la generación de un proceso inflamatorio crónico, estéril, desarrollado a bajo ruido a nivel sistémico, perpetuado por el tejido adiposo. En este sentido, la activación de las vías del inflamasoma está relacionada con la patogénesis de estas enfermedades. El inflamasoma es un complejo multiproteico señalizador que censa una gran variedad de moléculas del sistema inmune innato y que, su activación, produce la liberación de citoquinas proinflamatorias potentes (IL-1β e IL-18). Por este motivo, el desarrollo de nuevos fármacos antiinflamatorios, capaces de inhibir las rutas involucradas en la generación de procesos inflamatorios crónicos, en particular el inflamasoma, resulta fundamental. En nuestro laboratorio, hemos diseñado y sintetizado una nueva familia de fármacos formados por una estructura mimética del α-Tocoferol y un grupo nitroalquenilo que ejerce propiedades antiinflamatorias a través de la inhibición de Nfkb, del inflamasoma NLRP3, y de la activación de vías citoprotectoras (Nrf2/Keap1, HSF-1 y PPAR-g). Sintetizamos y evaluamos un análogo nitroalqueno derivado del Trolox™ (NATx0) que presenta resultados preliminares muy alentadores: posee alta reactividad frente a nucleófilos modelo, elevada inducción de enzimas dependientes del sistema Nrf2/Keap-1 (H0-1 y GCLM), inhibe NfkB, inhibe el inflamasoma NLRP3 en macrófagos THP-1 estimulados con LPS/ATP y disminuye la liberación de IL-1β en modelo de inflamación aguda en ratón por administración de LPS.

Contacto: dapuetor@gmail.com
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Resumen:
El cáncer de próstata (PCa) es el cáncer de mayor incidencia y el segundo en mortalidad en hombres. Aún no se dispone de marcadores que permitan distinguir entre las formas indolentes y las formas agresivas de la enfermedad, lo que conduce a la sobre-intervención médica que conlleva un aumento innecesario tanto de la morbilidad como de los costos de salud. Debido a su estabilidad, especificidad de expresión, accesibilidad en los fluidos corporales y simplicidad para la cuantificación, los microARNs constituyen una nueva oportunidad como biomarcadores en patología humana, además de presentar valor clínico en la predicción del tratamiento y la terapéutica.    Los microARNs que integran el clúster génico compuesto por miR-301b y miR-130b, han sido reportado como oncogénicos y supresores de tumor en diversos tejidos, habiendo en PCa reportes contradictorios. Aquí buscamos dilucidar su significación clínica en PCa, interrogando bases de datos de expresión génica de tumores que están disponibles públicamente.  Las mismas incluyen transcriptomas, metilomas, proteomas y diversos datos clínicos asociados a las muestras. Primeramente, se analiza la asociación entre los niveles de expresión de los dos microRNAs y el tipo de tejido prostático (normal, tumoral primario y secundario/metástasis), encontrándose un incremento de los mismos en tejido metastásico respecto al primario y en primario respecto al normal. En segundo lugar, se estudian los niveles de metilación del gen y su asociación con la expresión de los ARNs transcriptos, determinándose que si bien existe un leve incremento de la metilación de ADN del locus en tejido tumoral vs. normal, el mismo no afecta los niveles de microRNAs. Por último, se indaga si el nivel de miR-130b y 301b correlaciona con la evolución neoplásica, encontrándose una asociación con la recurrencia bioquímica y la metástasis. Estos resultados sugieren fuertemente una acción oncogénica de este locus en PCa.

Contacto: mduhagon@fcien.edu.uy
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Resumen:
En febrero de 2015 se reportó el primer brote autóctono de leishmaniasis canina en Uruguay, el mismo ocurrió en la localidad de Arenitas Blancas en el departamento de Salto. En la zona, un total de 49 perros fueron muestreados por test serológicos en donde 11 resultaron positivos para Leishmania sp; mediante captura entomológica se identificaron individuos de la especie Lutzomya longipalpis que posteriormente fueron confirmados positivos para Leishmania sp. Se realizó PCR y secuenciación de genes específicos tanto en las muestras caninas como en las muestras entomológicas y esto nos permitió alertar sobre la presencia del ciclo completo en nuestro país. También, mediante PCR-RFLP de tipificación, se logró determinar que la especie involucrada en el brote era Leishmania infantum. A partir de las muestras caninas identificadas en el brote, se obtuvieron cultivos axénicos estables de la forma promastigota de las cepas circulantes en medio semi-definido. Se procedió a la caracterización de las mismas mediante curvas de crecimiento y susceptibilidad a fármacos utilizados para el tratamiento de leishmaniasis. En una última instancia, también se logró establecer un modelo de infección en macrófagos humanos el cual representa una herramienta fundamental de trabajo hacia el conocimiento y caracterización de las cepas circulantes en nuestro país.

Contacto: pfaral@pasteur.edu.uy
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Resumen:
PtpA es un componente clave en la biología de Mycobacterium tuberculosis, tal como se ha demostrado en estudios con cepas mutantes en esta fosfatasa. Durante la infección PtpA alcanza el citosol de macrófagos dónde actúa sobre proteínas eucariotas. Nuestro grupo reportó recientemente cuatro potenciales sustratos eucariotas de PtpA. En este contexto, validar la interacción de la PtpA con estos candidatos a sustrato es fundamental para avanzar en el conocimiento de las vías celulares afectadas por este patógeno. Para ello era necesario disponer de una estrategia que permitiera evaluar en un contexto celular eucariota la interacción entre la PtpA de Mycobacterium tuberculosis y los candidatos a sustrato. Así, en este trabajo se logró poner en marcha el sistema de doble híbrido en levadura CytoTrap Vector (Stratagen) y se aplicó al estudio de la interacción entre la PtpA D126A (carnada en el sistema doble híbrido) y la proteína humana ECHA correspondiente a la subunidad alfa de la enzima clave de la beta-oxidación de los ácidos grasos  (presa en el sistema doble híbrido). En una primera etapa se insertaron los genes de interés en los plásmidos del sistema de doble híbrido mediante herramientas de biología molecular. Se logró clonar el gen de la PtpA D126A en el plásmido pSos, confirmándose la integridad de su secuencia bacteriana. Para la ECHA, se obtuvo el ADNc, y el producto de amplificación de dicho gen se clonó en el plásmido pMyr, confirmándose que corresponde a la isoforma 1 de la ECHA humana. Posteriormente se realizó el ensayo de doble híbrido, obteniéndose, en un primer experimento, el resultado esperado para los controles del ensayo y un resultado promisorio para la interacción de la PtpA-D126A y la ECHA humana. La etapa siguiente será aumentar el número de réplicas del ensayo para estar seguros de dicha conclusión.

Contacto: vivian.irving23@gmail.com
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Resumen:
Trypanosoma cruzi es el agente causal de la enfermedad de Chagas, considerada por la OMS como una enfermedad desatendida y un importante problema socio-económico en Latinoamérica. El parásito presenta diferentes estadíos a lo largo de su ciclo de vida. En el intestino del insecto vector se encuentran los parásitos en forma epimastigota no infectiva que se diferencian en el tracto rectal del insecto en tripomastigotas metaciclicos, estadío no replicativo responsable de la infección en mamíferos. Poco se sabe de la transición entre ambos estadíos. Experimentalmente se ha demostrado que el estrés nutricional desencadena el pasaje de epimastigotas a metacíclicos. Se ha propuesto que parásitos estresados en fase estacionaria constituirían un estadío diferente pudiendo diferenciarse a metacíclicos o volver al estadío epimastigota replicativo según las condiciones de estrés nutricional. Con el fin de caracterizar estos parásitos en fase estacionaria se realizaron curvas de crecimiento y se determinaron puntos claves para evaluar morfológicamente los parásitos mediante microscopía y citometría de flujo. Se estudiaron niveles de compactación de cromatina en los diferentes puntos mediante digestión del ADN con DNasa I a diferentes tiempos y se evaluó contenido de ARN por parásito. Se evaluó la resistencia al complemento de los parásitos mediante incubación con suero humano sin descomplementar y descomplementado por calor, para evaluar si estos parásitos en fase estacionaria son sensibles como los epimastigotas o resistentes como los tripomastigotas metacíclicos. En todos los casos se analizó la viabilidad de los parásitos mediante incubación con calceína y ioduro de propidio y posterior análisis por citometría de flujo. Estos resultados contribuyen a la caracterización de T. cruzi en fase estacionaria, un punto clave del ciclo de vida donde se determina su diferenciación hacia el estadio infectivo en la ampolla rectal del insecto.  

Contacto: fabricioh92@gmail.com
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Resumen:
Los cambios en los estilos de vida han determinado un constante incremento en la incidencia de enfermedades crónicas no transmisibles (ECNT), las que constituyen la principal causa de muerte a nivel mundial. Las complicaciones de la hipertensión arterial (HTA) producen una parte importante de los fallecimientos por ECNT. La injuria vascular constituye una de las principales consecuencias observadas en la HTA mantenida. Los mecanismos celulares y metabólicos involucrados en la injuria vascular son numerosos, complejos y multifactoriales, dentro de los cuales el sistema renina-angiotensina - aldosterona juega un rol protagónico. La Angiotensina II (ANGII) presenta un rol clave en la generación de inflamación, fibrosis, y apoptosis; modificaciones que se observan en la HTA. Sin embargo, los mecanismos moleculares que subyacen estos procesos aún no han sido completamente elucidados. Nuestro grupo ha venido trabajando en el rol de la proteína DBC1, un inhibidor de SIRT1, en la fisiopatología de las enfermedades cardiovasculares. Los ratones Knock Out (KO) para DBC1 están protegidos contra la aterosclerosis en situación de obesidad experimental. En este contexto, nos planteamos evaluar si DBC1 desempeña un papel relevante en la HTA. Los resultados obtenidos apoyan esta hipótesis. El tratamiento con ANGII in vivo induce la expresión de DBC1 tanto a nivel vascular como renal. Sorprendentemente, los ratones KO para DBC1 son más sensibles a la ANGII, mostrando una mayor tasa de mortalidad, mayor incidencia de aneurismas abdominales y alteraciones en la morfologia de la pared arterial. Por otro lado, a nivel renal parece existir una protección contra el daño producido por la AngII. Nuestros resultados sugieren que DBC1 juega un rol preponderante en las enfermedades cardiovasculares, aunque aún debemos comprender en profundidad los mecanismos involucrados.

Contacto: laura.colman@gmail.com
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Resumen:
La miocardiopatía chagásica es la manifestación más severa de la enfermedad de Chagas. A pesar de diversos estudios e investigaciones, su patogenia y los mecanismos biológicos responsables de las lesiones cardíacas no son aún comprendidos en su totalidad. En este trabajo identificamos vías biológicas alteradas en cardiomiocitos humanos a tiempos cortos de infección. Encontramos que a tan sólo 6 horas post-infección las mitocondrias aumentan su capacidad respiratoria junto con un aumento de su biogénesis. Esta respuesta puede deberse a que en los cardiomiocitos infectados se mostró un aumento en la activación de mTORC1 (mammalian target of rapamycin complex 1). Si bien un aumento de mTORC1 también supondría un aumento en la proliferación de estas células, no evidenciamos mayor proliferación en las células infectadas. Una de las vías biológicas que encontramos disminuida y que permitiría explicar esta aparente contradicción, es la vía de degradación del ARNm mediada por secuencias sin sentido (más conocido como NMD-Non sense mediated decay), dado que su disminución habilita, en el contexto de la infección, la expresión de genes responsables del arresto celular. El presente trabajo evidencia la complejidad de las múltiples interacciones huésped-parásito que ocurren a tiempos cortos de infección, las mismas pueden ayudar a comprender más profundamente la patogénesis de la miocardiopatía chagásica.

Contacto: glibisch@pasteur.edu.uy
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Resumen:
Las metacaspasas fueron descubiertas inicialmente a partir de datos de secuenciación de genomas vegetales, en base a homología de secuencia con caspasas de animales. Al igual que las caspasas, estas proteasas han sido implicadas desempañando roles fisiológicos diversos, más allá de su participación en la muerte celular programada. Su análisis filogénetico permite determinar que son ubicuas en el reino vegetal y que muy tempranamente divergieron en dos grupos estructuralmente diferentes: las metacaspasas de tipo I y II, siendo éste último exclusivo de las plantas. Physcomitrella patens es una briofita, que conserva varias de las características de las primeras plantas que colonizaron la tierra, por lo cual resulta interesante su estudio para el análisis evolutivo de esta familia de genes. En esta planta identificamos dos genes de metacaspasas de tipo I y cuatro de metacaspasas de tipo II, a la vez que también se identificó una secuencia que sería un pseudogen de metacaspasa. Esta temprana diversificación de los miembros de esta familia de proteasas, es apoyada por los diferentes niveles de expresión de los miembros de esta familia y por la diversidad de patrones de distribución subcelular que hemos encontrado. En este trabajo se muestran los estudios de localización subcelular de todas las metacaspasas de P. patens. Mayores estudios están siendo llevados a cabo a fin de contribuir a determinar la probable subfuncionalizacion de los miembros de esta familia.

Contacto: marcelb@fcien.edu.uy
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Resumen:
Las células están expuestas a especies reactivas de oxígeno y nitrógeno, originadas como subproductos metabólicos o en el medio ambiente. Una producción descontrolada y/o neutralización insuficiente de estos compuestos es capaz de alterar el equilibrio redox celular causando daño en las macromoléculas. Las células están equipadas con distintos sistemas que controlan la homeostasis redox tiol-disulfuro a nivel intracelular. En los tripanosomátidos, el tripanotión (bis-glutationilespermidina, tiol de bajo peso molecular) reemplaza el sistema ubicuo de glutatión. El desarrollo reciente de biosensores basados en proteínas fluorescentes que permiten monitorear el estado redox intracelular en tiempo real e in situ, de manera no invasiva, y  dinámica,  nos ha impulsado a validar el empleo de estas herramientas para estudiar los fenómenos redox que ocurren durante los procesos de respuesta a estrés, diferenciación celular e interacción huésped-parásito. Se han desarrollado variantes redox sensibles de la proteína verde fluorescente (roGFP2) capaces de monitorear el pool de glutatión reducido y oxidado. En este trabajo se utilizó un biosensor de tercera generación, una fusión de la glutarredoxina 1 humana (hGrx) y la GFP2 redox sensible (roGFP2) y se generó un nuevo biosensor con corrimiento espectral hacia el rojo (rxmRuby2). Este nuevo biosensor será de gran utilidad para imagenología in vivo sobre animales, tejidos o células, ya que en esa zona espectral no existe interferencia por autofluorescencia de moléculas endógenas. Se realizó la caracterización in vitro de la respuesta de la proteína recombinante hGrx-roGFP2 frente a los pares redox más relevantes para el parasito y se generaron las líneas reporteras transgénicas de Trypanosoma brucei y  de Trypanosoma cruzi. El nuevo biosensor rxmRuby2 fue expresado, purificado y caracterizado de manera  bioquímica. Análisis espectrofluorimétricos muestran que el biosensor es capaz de responder de manera reversible a estímulos redox a diferentes pH en el rango fisiológico.

Contacto: fsardi@pasteur.edu.uy
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Resumen:
Los abejorros del género Bombus (Hymenoptera; Apoidea) son insectos eusociales de ciclo anual. En la actualidad, son reconocidos como excelentes polinizadores debido a que presentan características que los hacen eficientes en diversos cultivos de importancia económica. Por tal motivo, sus colonias han comenzado a comercializar en muchos países. Los abejorros pueden albergar un gran número de ácaros de fácil transmisión, que afectan la vida de las colonias. Es posible que los sistemas de cría donde se encuentran en situación de confinamiento, aumente la incidencia de diferentes ectoparásitos. Entre éstos, se destacan diversos ácaros foréticos pertenecientes al amplio grupo Acariforme. En Uruguay, contamos con la presencia del abejorros nativo, Bombus atratus, la que ha sido sujeta a exitosas experiencias de cría en condiciones de laboratorio. En este estudio se analizaron abejorros de la especie B. atratus (75) criados en laboratorio y se determinaron las especies de ácaros presentes en sus cuerpos. Las diferentes especies encontrados fueron: Tyrophagus putrescentinae, Kuzinia americana, Pneumolaelaps longanalis P. longipilus. El 65% de los abejorros presentaron por lo menos un ácaro, dentro de los infectados la gran mayoría (95%) es hospedero de la especie T. putrescentinae. Las demás especies de ácaros se distibuyeron en el resto de abejorros analizados, y en un solo abejorro se dió el caso de una coinfección por dos ectoparásitos (T. putrescentinae y K. Americana). Si bien T putrescentinae, el más presente en las muestras, no afecta directamente la salud de los abejorros, está asociado a la falta de higiene de la colonia  y puede contribuir a la aparición de otras afecciones como microsporidios, hongos, etc. Este trabajo abre la posibilidad de implementar el estudio de la acarfauna como una herramienta para evaluar el estado sanitario de las especies de abejorros en el país, permitiendo así contribuir en su conservación.

Contacto: ortizadrianbiologia@outlook.es
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Resumen:
Pseudomonas aeruginosa es un patógeno oportunista capaz de causar la muerte a individuos inmunocomprometidos. Representa un problema importante a nivel de la salud, ya que es el 3^er o 4^to aislamiento hospitalario más común. Constituye la principal causa de muerte en individuos con fibrosis quística, siendo la formación de biofilms un factor clave en la resistencia a antibióticos y la cronicidad de la infección. La transición desde una forma de vida planctónica a una asociada a superficie, es un paso temprano crucial en la formación de biofilms y el establecimiento del proceso infectivo. En este sentido, el segundo mensajero 3´,5´-diguanilato cíclico (di-GMPc) juega un rol central en la transición desde un estado móvil y de vida libre a uno sésil, multicelular y asociado a superficie. La síntesis de di-GMPc es, catalizada por diguanilato ciclasas, mientras que su hidrólisis es catalizada por fosfodiesterasas. El genoma de P. aeruginosa codifica un gran número de enzimas con actividad diguanilato ciclasa y fosfodiesterasa, y en base a caracterizaciones fenotípicas de cepas donde estos genes han sido individualmente eliminados, se ha postulado que cada una de estas enzimas tiene un rol biológico diferente. En este trabajo caracterizamos una cepa de P. aeruginosa que sobreexpresa una fosfodiesterasa específica de di-GMPc. Utilizando estrategias proteómicas cuantitativas y ensayos fenotípicos demostramos que existen cuatro procesos o estructuras afectados en esta cepa: la formación de biofilms, el ensamblaje de flagelo, la expresión de quimioreceptores y la expresión del sistema de secreción tipo III. Mediante el uso de un mutante enzimáticamente inactivo pudimos demostrar que algunos de los procesos afectados no dependen de la actividad fosfodiesterasa. Basados en estos resultados inesperados nombramos a PA2133 como FcsR (Flagellar, chemotaxis and type III secretion Regulator).

Contacto: jrossello@pasteur.edu.uy
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Resumen:
El mal de Chagas es una enfermedad endémica de América Latina, potencialmente letal, y para la cual no existen terapias efectivas y seguras hasta el momento. Se estima que más de 10.000 personas mueren diariamente en el mundo por manifestaciones clínicas de esta enfermedad. El agente etiológico de la enfermedad de Chagas es el parásito protozoario Trypanosoma cruzi, el cual cursa un ciclo de vida entre el insecto vector (vinchuca) y el hospedero vertebrado (hombre). La etapa aguda de la infección en el hombre se caracteriza por elevadas parasitemias, invasión tisular e infiltrado inflamatorio. En esta fase la respuesta inmune innata, en particular la acción de las células fagocíticas, es fundamental para neutralizar la invasión del parásito. Entre los principales mecanismos efectores de estas células se encuentra la formación de radical superóxido intrafagosomal por parte de la enzima NADPH oxidasa o Nox2. Este radical puede generar daño oxidativo en el parásito gracias a la formación de especies derivadas como el peróxido de hidrógeno o el peroxinitrito (producto de reacción con óxido nítrico). Evidencias previas en este y otros modelos de infección a macrófagos muestran que la enzima Nox2 es crucial para el control de infecciones por microorganismos. En este trabajo, realizamos infecciones en macrófagos derivados de ratones KO para Nox2 y demostramos que la ausencia de esta actividad enzimática resulta en una pérdida dramática de la capacidad de controlar la infección.  Por otro lado, resultados preliminares de infección in vivo de ratones KO con T.cruzi muestran que, si bien las parasitemias no empeoran, la invasión tisular es mayor en los ratones deficientes en Nox2 y los animales mueren prematuramente. La literatura presenta resultados contradictorios en este aspecto y es importante dilucidar el rol de Nox2 en la infección por T.cruzi para entender la biología de la interacción parásito-hospedero.

Contacto: carolinaprolo@gmail.com
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Resumen:
La geosmina es un compuesto generado por diversos microorganismos en la tierra y agua. En el suelo es formado por estreptomicetos y es el causante del olor “a tierra” que surge luego de una lluvia. En el agua existen algas y cianobacterias que producen geosmina, 2-metilisoborneol y otros compuestos que confieren al agua olor y sabor a moho y tierra. Las actividades humanas favorecen la proliferación de algas y cianobacterias por lo que muchas veces aparecen olores y sabores desagradables en aguas de consumo, que son difíciles de eliminar. Químicamente es un derivado trisustituido del biciclo[4.4.0]decano. Como tal, esta estructura posee tres átomos de carbono quirales y por tanto ocho estereoisómeros posibles (cuatro pares de enantiómeros). Específicamente, la geosmina natural es  (-)-(4S, 4αS, 8αR)-4,8-dimetiloctahidronaftalen-4-ol. Los humanos pueden detectar este compuesto a concentraciones muy bajas en el agua (del orden de nanogramos en un litro). La cuantificacion de geosmina en aguas se puede realizar por métodos cromatográficos (GC o HPLC). En ambos casos se debe disponer de un estándar, el cual tiene un costo elevado (aproximadamente 500 dolares americanos los 5 mg). En este trabajo, que se encuentra en etapas iniciales en nuestro laboratorio, se describe una aproximación a la sintesis de geosmina. El compuesto se obtuvo (como mezcla de estereoisómeros) en tres etapas: reaccion entre 2-metilciclohexanona con etilvinilcetona para formar un intermedio biciclico el cual se trata con 1,2-etanoditiol para formar un tiocetal y posterior desulfurizacion con níquel Raney. Los intermedios de reaccion y el producto final fueron obtenidos con rendimientos moderados y caracterizados espectroscópicamente (RMN y EM). En una etapa posterior se planea realizar la síntesis de la (-)-geosmina    

Contacto: gjsagrera@gmail.com
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Resumen:
Una cadena polipeptídica en el contexto celular puede adoptar una o mas conformaciones alternativas, sin embargo poner en evidencia las diferentes conformaciones constituye un desafío. En el marco de una línea de investigación de nuestro laboratorio centrado en las variaciones de conformación del receptor de estrógenos en células MCF7, analizamos su perfil de degradación por quimotripsina, mediante electroforesis y western blot.  La proteólisis limitada en una aproximación experimental muy sensible y la detección mediante el uso de anticuerpos requiere conocer con precisión su  especificidad respecto al receptor de estrógenos.  En este trabajo se describen las condiciones de cultivo celular de células MCF7, la preparación de los extractos celulares y de los inmunoprecipitados empleando dos anticuerpos monoclonales desarrollados contra el receptor de estrógenos, para comparar las proteínas reconocidas por ambos anticuerpos y validar los resultados.

Contacto: marcosdavyt@gmail.com
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Resumen:
La 2,4 DiEtilamina (2,4-DE) es un agroquímico herbicida sintético, amina secundaria del ácido-2,4-diclorofenoxiacético (2,4-DCFA). De acuerdo con OMS, derivados del 2,4-DCFA son agroquímicos clase II (moderadamente peligrosos). Su mecanismo de acción comprende oxidación vía óxido nítrico, teniendo como blanco diversas moléculas centrales para la vida celular. Se usa extensivamente en Uruguay (aprox. 1000 toneladas/año/2011). Existen pocos estudios de sus efectos sobre la salud humana. En este trabajo evaluamos el efecto a exposición aguda de 2,4-DE sobre la función cardíaca. La cinética de aplicación de este agroquímico a dosis 1 uM,  muestra que alcanza el estado estacionario en efectos en 10-15 minutos. Las curvas dosis-respuesta (CDR)  en estado estacionario de amplitud de tensión,  muestran un efecto bifásico con un efecto inotrópico negativo entre 0-5 uM e inotrópico positivo entre 5-20 uM. Las CDR de tensión sistólica (TS) y diastólica (TD)  muestran también un comportamiento bifásico, disminuyendo ambas hasta 2 uM 2,4-DE. La CDR de tiempo medio de activación decae monofásicamente, con un IC50 de aprox. 13 uM. No se observaron cambios significativos para el tiempo medio de relajación. La frecuencia cardíaca también mostró un comportamiento bifásico, subiendo aprox. 30% a dosis menores a 1 uM, para disminuir y estabilizarse con dosis mayores a 1 uM. A dosis entre 0.5 y 10 uM aumenta marcadamente la generación de comportamientos arrítmicos, consistiendo éstos sobre todo en extrasístoles, pausas extrasistólicas y focos ectópicos, produciendo alteraciones de contractilidad. Estos resultados son consistentes con al menos un blanco de acción en los receptores Ryr-2, dado el cambio en tiempo medio activación y el comportamiento bifásico de la liberación de calcio, ante oxidación de los mismos.

Contacto: florencia26savio@gmail.com
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Resumen:
  El azinfosmetil (AZM) es un agroquímico sintético insecticida del grupo de los organofosforados, clasificado por la OMS de acuerdo a su toxicidad y riesgo ambiental como clase Ib (altamente peligroso para la salud). Como todos los organofosforados (OF), sus efectos neurotóxicos se deben a inhibición de la acetilcolinesterasa por reacción de su forma Glutaoxón con el grupo hidroxilo de Serina en sitio activo de la acetilcolinesterasa. Al respecto, comparte este mecanismo de acción con el Malatión, que sufre el mismo proceso. Desde el año 2016, por res. 107 del MGAP, su uso en el país se ha prohibido totalmente. Este OF ha sido y es usado también como arma química, a pesar de estar prohibido su uso por la Convención de Ginebra. En este trabajo decidimos evaluar si al igual que otros OF, AZM puede actuar directamente en corazones aislados y retroperfundidos mediante el método de Langendorff. La cinética de acción se da en plazos de perfusión más prolongados que para otros OF, demorando aprox. 10-30 min en llegar al estado estacionario. Nuestros resultados indican que AZM, al igual que otros OF tiene también un efecto inotrópico negativo, con un IC50 de 20 + 10 uM. La tensión diastólica aumenta con dosis crecientes de AZM. Los tiempos medios de activación y relajación aumentan 150% y 40% respectivamente. Tiene también un efecto cronotrópico negativo en dosis similares a las que provocan inotropismo negativo. Se acompaña de trastornos del ritmo frecuentes consistentes en contracciones alternantes y extrasístoles ventriculares frecuentes, especialmente a dosis intermedias. Estos datos sugieren que AZM es capaz de ejercer efectos a nivel cardíaco, independientes de su acción anticolinesterasa, probablemente por efectos en canales de Calcio tipo L/Ryr2 y/o potasio, dada la inestabilidad observada en procesos que dependen de la homeostasis de Calcio intracelular.

Contacto: florencia26savio@gmail.com
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Resumen:
El clorpirifós (CPF) es un insecticida organofosforado (OF) sintético, que tiene efectos directos en la contractilidad y excitabilidad cardíacas, según reportamos en Alonso et al., 2015 y 2017 (ver resumen en este evento). En situación control, la restricción a la retroperfusión con Tyrode 1.8 mM, anula la capacidad contráctil cardíaca en aprox. 4 minutos en cobayos, reestableciéndose en un 100% en aproximadamente 3 min de reperfusión. Cuando se someten los corazones aislados a una dosis de CPF comercial de 13.7 uM, la contractilidad disminuye y aumenta con la reperfusión, con una cinética similar a la situación control. Sin embargo los valores de amplitud contráctil alcanzados en la reperfusión son francamente inferiores (50%), al restablecimiento de 100% que se observa en la situación control. Este porcentaje de recuperación cae a 33% cuando se incrementa la dosis de CPF de 13.7 a 41.1 uM. La frecuencia cardíaca (fc) cae y se recupera de manera similar al inotropismo ante control y  CPF comercial. Sin embargo la recuperación de la fc ocurre siempre a un 100% respecto a la situación anterior tanto en situación control como en exposición aguda a CPF comercial. No se observó un incremento de la tasa de arritmias entre la isquemia y reperfusión de situación control respecto a la misma ante exposición aguda a CPF comercial en dosis de 13 a 41 uM. Interesantemente, el uso de cardioprotectores opiáceos (remifentanilo 10 nM), empeora dramáticamente la situación frente a la exposición aguda a CPF comercial, conduciendo a la fibrilación ventricular. Nuestros resultados sugieren que CPF en dosis uM, altera corrientes por canales de Calcio-L u otros pro-contráctiles, (observadas en situación de independencia de isquemia o reperfusión), cambiando el efecto agonista de remifentanilo por un efecto antagonista del mismo cuando ha sido sometido previamente a la exposición aguda de CPF.

Contacto: romicardozofourcade@hotmail.com
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Resumen:
El clorpirifós (CPF) es un agroquímico sintético insecticida del grupo de los organofosforados, clasificado por la OMS de acuerdo a su toxicidad y riesgo ambiental como clase II (moderadamente peligroso para la salud). Actúa por inhibición reversible de la acetilcolinesterasa. Previamente, reportamos que la exposición aguda a CPF comercial es capaz de originar daño directo a nivel cardíaco, independientemente de su acción anticolinesterasa (Alonso et al, 2015). Sin embargo, los excipientes sintéticos podrían explicar estos hallazgos. Con el objetivo de demostrar que los efectos observados se deben mayoritariamente al principio activo CPF de los preparados comerciales, repetimos los experimentos con el agroquímico purificado analíticamente. Nuestros resultados en corazones aislados muestran que la cinética de acción de CPF puro ejerce sus efectos a los 3 min de su aplicación extracelular, pudiendo estar limitado por la perfusión del sistema. Al igual que el preparado comercial, CPF puro tiene un marcado efecto inotrópico negativo (IC50~40µM). El preparado puro al igual que el comercial, aumenta marcadamente la tensión diastólica (aprox. 10 veces). La velocidad de relajación con CPF puro, disminuye aprox. 20% y la de activación aumenta aprox. 20%. CPF puro es también cronotrópico negativo al igual que su preparado comercial con IC50 comparable. Ambos originan arritmias del tipo alternancia mecánico-eléctrica a dosis similares a las observadas para sus efectos crono e inotrópico. Estos resultados muestran que CPF ejerce directamente sus efectos sobre corazones aislados, posiblemente a través de canales de Calcio L, potasio y/o receptores de ryanodina/SERCA, independientemente de su acción anticolinesterasa y que los efectos reportados previamente por nuestro grupo, tampoco se explican por excipientes agregados a los preparados comerciales.  Financiado por CSIC I+D 146 a GF

Contacto: romicardozofourcade@hotmail.com
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Resumen:
La albúmina sérica humana (HSA) está formada por tres dominios y contiene una única cisteína libre (Cys34) localizada en el dominio I (DomI). Las escasas defensas antioxidantes del plasma y la alta concentración de HSA la convierten en blanco de especies oxidantes. Este trabajo busca profundizar en la caracterización de los derivados oxidados de la Cys34 utilizando el DomI recombinante producido en la levadura Pichia pastoris. La proteína es secretada al medio de cultivo del cual se purificó por precipitación con sulfato de amonio. Junto con el DomI precipitó un pigmento de color marrón que podría corresponder a una mezcla compleja derivada de carbohidratos, con carga neta negativa. Para separar el pigmento del DomI se evaluaron dos cromatografías considerando un punto isoeléctrico de 5.4 para el DomI. Primero se realizó una cromatografía de intercambio aniónico (DEAE sefarosa; amortiguador inicio: acetato de amonio 20 mM, pH 5.2; elución: acetato de amonio 20 mM, pH 5.2, NaCl 1 M). Si bien se logró una purificación parcial del DomI, parte del pigmento quedó fuertemente adsorbido a la resina dificultando su regeneración. Segundo, se evaluó una cromatografía de intercambio catiónico (CM sefarosa; amortiguador inicio: acetato de sodio 20 mM, pH 5; elución: acetato de sodio 20 mM, pH 5, NaCl 1 M). El análisis por espectrofotometría y SDS-PAGE mostró la presencia de la mayor parte del pigmento y proteínas contaminantes en la fracción no unida, mientras que el DomI se encontró en el eluido. Al determinar la concentración de proteína de las fracciones con el método del ácido bicinconínico se observaron interferencias debido al pigmento, mientras que el método de Bradford resultó más adecuado. Actualmente se está trabajando en la reducción y cuantificación del tiol de la Cys34 para posteriormente comenzar con los ensayos cinéticos y estructurales.

Contacto: martinasteglich@fcien.edu.uy
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Resumen:
El cáncer, es el resultado ­­­­­­de alteraciones en ciertos genes que inducen el crecimiento descontrolado de células malignas. Esta enfermedad es la segunda causa de mortalidad más frecuente en el mundo y en general los tratamientos para combatirlo son poco eficaces y seguros por lo que la búsqueda de nuevos compuestos con acción anti-tumoral es de suma importancia. Recientemente, compuestos con acción liberadora de óxido nítrico (NO) han tenido un gran impacto para su potencial uso como anti-tumorales, y se ha comprobado que su actividad biológica anti-proliferativa está directamente relacionada con la capacidad liberadora de NO. La mayoría de los métodos que se utilizan actualmente para determinar la proliferación celular sólo miden un parámetro celular, por lo que son limitados y propensos al error. Este trabajo describe la determinación de la actividad anti-proliferativa in vitro a través de la medida de la actividad metabólica y la masa celular junto con la actividad liberadora de NO utilizando de una serie de ensayos en tándem para la misma muestra empleando los ensayos de resazurina, sulforodamina B y Griess. Adicionalmente, se evaluó el posible mecanismo de acción de los compuestos a través del ensayo cometa. En el presente estudio, se ha logrado desarrollar una forma rápida, sencilla, económica y reproducible para determinar la actividad anti-proliferativa y liberadora de NO en una misma muestra evitando la variación asociada con los diferentes ensayos y cambios de las condiciones externas. Los resultados obtenidos para los compuestos derivados de furoxano que fueron evaluados con esta serie de ensayos en tándem, mostraron una importante acción anti-proliferativa. Se ha demostrado una vez más que la entidad liberadora de NO es fundamental para obtener la actividad biológica deseada y responsable de inducir daño al ADN en células tumorales.

Contacto: floperezlobo@gmail.com
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Resumen:
Los organismos están constantemente expuestos a especies reactivas de oxigeno (ROS), que se producen como productos secundarios del metabolismo o como efectores, y pueden oxidar proteínas, lípidos y ácidos nucleicos. Cuando la producción de especies reactivas supera la capacidad antioxidante, resulta en un estrés oxidativo que puede contribuir al daño celular y al envejecimiento. Uno de los principales blancos del daño oxidativo son las proteínas, dada su abundancia y reactividad. Recientemente encontramos que ciertas oxidaciones llevan a la formación de productos electrofílicos, particularmente en Tyr, His y Trp, que pueden seguir reaccionando y podrían constituir un mecanismo importante de daño proteico. En este trabajo estudiamos la formación de derivados electrófilos en péptidos y proteínas como indicadores del estado oxidativo. Para ello se sintetizaron distintas sondas nucleofílicas que nos permiten detectar dichos derivados, y se trabajó con glutatión conjugado al grupo fluorescente  fluoresceína (FGSH).  Las primeras pruebas se realizaron en el dipéptido glicil-tirosina (GY), que cuando se oxida con oxígeno singulete genera el derivado electrofílico glicil-HOCHDA (GH). GH reaccionó con la sonda FGSH, y el aducto fue caracterizado por espectrometría de masa y cuantificado por UV-HPLC. Luego se utilizó la proteína ribonucleasa, esta se oxidó utilizando diferentes sistemas: oxígeno singulete, radical peroxilo (generado por ABAP), radical hidroxilo (peróxido de hidrógeno y Fe²⁺) y peroxinitrito. En todos los casos se evidenció la formación de productos electrófilos mediante la unión covalente con F-GSH. Los aductos en proteínas se cuantificaron utilizando cromatografía de exclusión molecular con detección UV-vis y fluorescencia. Se observó una variación cuantitativa en la formación de productos electrófilos generados por los distintos sistemas que eventualmente podría usarse como huella dactilar. Se sigue trabajando en la identificación de las modificaciones oxidativas y residuos que llevan a la formación de electrófilos en esta proteína.

Contacto: anclalop@fcien.edu.uy
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Resumen:
La alta concentración a la que se encuentran las macromoléculas en el interior celular, lleva a un hacinamiento molecular que provoca particulares condiciones fisicoquímicas en el citosol y demás compartimientos celulares. En este trabajo proponemos que la alta densidad a la cual las proteínas están presentes en bioambientes celulares, permite reacciones radicalares de propagación entre diferentes cadenas polipeptídicas. En este trabajo estudiamos la propagación de modificaciones oxidativas proteicas en soluciones de albúmina sérica bovina (BSA) a concentraciones que simulan el hacinamiento molecular celular, mediante estudios de oximetría, fluorescencia, y resonancia paramagnética electrónica. Por otro lado, estudiamos el efecto de compuestos derivados de nitronas, tert-butil-fenilnitrona (PBN) y dimetilpirrolina N-oxido (DMPO), sobre los fenómenos de propagación observados. Clásicamente, estos compuestos han sido utilizados para evidenciar la formación de radicales en reacciones químicas o enzimáticas. A su vez, estos compuestos han sido probados en diferentes modelos animales de enfermedad, e incluso en ensayos clínicos, como agentes para la protección de modificaciones oxidativas. Por tanto, utilizamos estos agentes en nuestros experimentos y demostramos que tanto PBN, como DMPO, fueron capaces de interrumpir la propagación de reacciones radicalares. Estos resultados apoyan el concepto de que en ambientes hacinados, el daño oxidativo puede ser inducido y amplificado via reacciones radicalares en cadena, mediados por proteínas y dependientes de oxígeno, y que a su vez, compuestos atrapadores de espín son capaces de interrumpir la propagación de estas modificaciones.

Contacto: aaicardo@gmail.com
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Resumen:
Nuestro grupo de trabajo estudia el efecto del uso diferencial de codones sobre la cinética de traducción y su relación con la estructura y funcionalidad del transportador de urea de Aspergillus nidulans, UreA. Dentro de esta línea se generó un mutante de este transportador en el cual dos codones de uso poco frecuente (codones 24 y 25; 24/25) que codifican para aminoácidos presentes en el extremo N-terminal de UreA, se sustituyeron por dos codones de uso frecuente. El resultado fue una disminución en los niveles de UreA en la membrana celular y por ende un crecimiento deficiente sobre urea. Se comprobó que estos efectos no se debían a una mayor degradación del transportador ni tampoco a diferencias en los niveles de ARNm entre la cepa salvaje y el mutante, ni a alteraciones en la estructura secundaria. En base a estos resultados, la hipótesis del grupo es que la mutación sinónima de los codones 24/25 afecta etapas muy tempranas en la síntesis de UreA. Se plantea entonces la posibilidad de que la mutación en los codones 24/25 fuera la responsable de la pérdida de una pausa traduccional. Ésta sería necesaria para la correcta interacción de los complejos ribosoma-cadena polipeptídica naciente que traducen UreA (RNC-UreA) con la partícula de reconocimiento de señal (SRP). Para determinar el posible rol de los codones 24/25 en la interacción de los RNC-UreA con SRP, se están desarrollando experimentos basados en ensayos de traducción in vitro de A. nidulans. Para realizar estos experimentos es necesaria la producción de anticuerpos que reconozcan a SrpA (proteína de A. nidulans homóloga a Srp54, subunidad más conservada del complejo SRP). Para cumplir con este fin se llevó a cabo la producción en forma recombinante de SrpA en Escherichia coli.  

Contacto: agusgonzalezcifuentes@gmail.com
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Resumen:
Los gliomas son los tumores más peligrosos del sistema nervioso central con una alta incidencia de muerte dependiendo de las características y estadío al momento del diagnóstico. La ausencia de marcadores confiables sobretodo en etapas tempranas y terapias anti-glioma eficaces conspiran contra el pronóstico favorable para quienes sufren de esta enfermedad. La investigación en ambas problemáticas es altamente dependiente de modelos animales que reproduzcan fielmente los tumores humanos. Los modelos de trasplante celular son de los más populares, sin embargo, los hallazgos patológicos de los tumores inducidos son a menudo diferentes de los gliomas humanos y la demanda de inmunosupresión que usualmente requiere el trasplante impide reproducir las interacciones tumor-microambiente que ocurren en los pacientes. En este trabajo se presenta el desarrollo tumorigénesis cerebral utilizando el carcinógeno N-metil-N-nitrosourea (MNU) en forma directa o indirecta.  La modalidad de trasplante singénico ortotópico de células transformadas con MNU en animales inmunocompetentes logró inducir neoplasmas únicos en el 90% de los animales inyectados, en ubicaciones y a tiempos reproducibles en todos los casos. La caracterización primaria reveló que los tumores desarrollados son infiltrantes y expresan marcadores de células madre tumorales y de precursores de progenitores gliales. La masa tumoral primaria presenta zonas proliferativas con células gigantes que muestran núcleos atípicos multi-lobulados y vasos sanguíneos de apariencia anormal. Todas características, similares a las encontradas en gliomas humanos y difícilmente reproducibles en los modelos usuales. Dado que el modelo desarrollado supera varias de las principales desventajas asociadas a los modelos de trasplante celular proponemos que puede ser una potencial herramienta para el estudio de la biología básica de los gliomas, así como para la investigación diagnóstica y terapéutica.

Contacto: ignacio.mastandrea@gmail.com
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Resumen:
Los persulfuros (RSSH) son probables intermediarios en la inducción de los efectos fisiológicos reportados para el sulfuro de hidrógeno (H₂S) en mamíferos. Este trabajo muestra la puesta a punto de un método para obtener preparados de persulfuros con el fin de estudiar su estabilidad y sus propiedades como nucleófilo y electrófilo. Se ha reportado que se obtiene persulfuro de cisteína a partir de cistina por acción de la cistationina β-sintasa (CBS)¹. En primer lugar, se purificó CBS humana trunca, carente de los 143 aminoácidos C-terminales, a partir de una cepa BL-21 (DE3) de Escherichia coli transformada con el plásmido pGEX4T1/hCBSΔC143 que codifica para la CBS unida a la glutatión S-transferasa. La CBS fue purificada por cromatografía de afinidad con glutatión sefarosa y la etiqueta removida con trombina. Una vez obtenida la enzima, se incubó con cistina para formar persulfuros, que fueron cuantificados por el método de cianólisis fría. Este método consiste en la reacción entre cianuro y los persulfuros para formar tiocianato y en la posterior detección del tiocianato formado con cationes férricos en medio ácido que forma un complejo coloreado que absorbe a 460 nm. Se comparó el rendimiento a distintos tiempos y diferentes concentraciones de sustrato y enzima. Además, se evaluó el efecto generado por la adición de piridoxal-5’-fosfato, el cofactor catalítico de la CBS. Si bien este método presenta ciertos inconvenientes debido a la baja solubilidad de la cistina, se logró formar persulfuros de cisteína exitosamente, aunque se obtuvo un rendimiento bajo, 3-4 % respecto a la cistina inicial. Actualmente se está explorando la formación de H₂S a partir de la reacción entre glutatión y el persulfuro de cisteína obtenido a partir de cistina y CBS. ¹Yadav, P.K. et al. J. Am. Chem. Soc., 2016, 138, 289-299.

Contacto: dbenchoam@fcien.edu.uy
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Resumen:
Gymnotus omarorum es una especie solitaria de pez eléctrico, de descarga débil dulceacuícola, que se distribuye en la región subtropical sudamericana siendo, dentro del orden Gymnotiformes, la especie más ampliamente distribuida y abundante en Uruguay. G. omarorum constituye un tradicional modelo neuroetológico que ha aportado al conocimiento anátomo-funcional de electrorrecepción activa. Recientemente, se ha identificado que esta especie de pez teleósteo despliega agresión exclusivamente territorial, única hasta el momento, lo que lo converte en un modelo de elección para la búsqueda de mecanismos neuroendócrinos que modulan este comportamiento. Un escollo importante para el desarrollo de estas investigaciones es la falta de información genómica de la especie, que imposibilita abordajes moleculares como la evaluación de la expresión génica diferencial. Con dicho objetivo, se secuenciaron de manera masiva muestras de ARN provenientes de cuatro tejidos distintos de dos ejemplares de esta especie, obteniendo 20 millones de lecturas pareadas por tejido. Las secuencias fueron analizadas conjuntamente y se ensambló un transcriptoma de referencia utilizando Trinity. Distintos programas como Transrate, Transdecoder, Blastx, Trinotate, Findorf, GhostKOALA e Interpro fueron utilizados para depurar el ensamblado y corregirlo, así como para encontrar transcriptos codificantes para proteínas y proceder a su anotación. Brevemente, el transcriptoma de referencia cuenta con 284.000 transcriptos, donde 30.000 representan el 90% del total de valores de expresión. Mientras que Transdecoder identificó 94.000 ORFs de más de 100 aminoácidos, Findorf encontró 48.600 proteínas, siendo la mitad full length. Se construyó un archivo de anotación muy extenso, para el transcriptoma generado, con información para casi 50.000 de los transcriptos identificados. Este trabajo aporta por primera vez información genómica de la especie mediante la secuenciación del transcriptoma y la anotación de genes de G. omarorum y se suma al banco de datos de otras 4 especies del orden Gymnotiformes disponibles en www.efishgenomics.integrativebiology.msu.edu. Financiación: ANII-FCE_1_2014_1_104272

Contacto: g.eastman.roge@gmail.com
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Resumen:
La enfermedad de Chagas es una enfermedad potencialmente mortal causada por el parásito protozoario Trypanosoma cruzi, y constituye un importante problema de salud pública principalmente en América Latina, perteneciendo al grupo de las enfermedades desatendidas. En busca de potenciales agentes antichagásicos, se sintetizó y caracterizó un nuevo compuesto basado en vanadio. En este trabajo se evaluó la actividad de este compuesto, el cual muestra valores de IC₅₀ en el rango micromolar sobre T. cruzi con un buen valor de índice de selectividad. Para evaluar el efecto de estos compuestos en la morfología de parásitos tratados, se tomaron imágenes de microscopía. Se observa en estos parásitos morfología redondeada, pérdida de flagelo y pérdida de movilidad a medida que aumenta la concentración de compuesto. Con el fin de profundizar el estudio del modo de acción del mismo, se utilizaron sondas fluorescentes como marcadores de apoptosis y necrosis, para determinar el mecanismo de muerte celular que induce. En las condiciones analizadas no se observa una tendencia directa a la muerte celular por ninguno de los mecanismos estudiados. La complementación de este ensayo con marcadores de viabilidad y vitalidad celular para determinar el efecto sobre el metabolismo celular, no mostró cambios significativos de la actividad esterasa en parásitos tratados. Además, se observa una disfunción mitocondrial mediada por una inducción del colapso del potencial de membrana. Para ampliar este análisis biológico, se analizaron los cambios globales en el transcriptoma de parásitos incubados con el complejo. Por ontología génica se observan modificadas las funciones oxidorreducatasa y de transporte transmembrana y a nivel celular las mitocondrias. Se espera al profundizar este análisis identificar posibles vías afectadas para entender el modo de acción de este prometedor compuesto. Por otro lado, se pretende complementar estos análisis con estudios proteómicos.

Contacto: mmosquillo@fcien.edu.uy
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Resumen:
En el Río de la Plata y en los grandes embalses de nuestro país y la región las floraciones de Microcystis dominan el fitoplancton especialmente durante la temporada estival, y sus efectos ecosistémicos requieren mayor atención. En estos cursos de agua los niveles de toxinas (microcistinas, MCs) alcanzan máximos estacionales de 10-20.000 µgL^-1 o más,  representando un riesgo muy elevado para humanos o animales tanto por contacto directo como por consumo de agua o alimentos contaminados. Hemos desarrollado métodos inmunoquímicos sencillos, selectivos y económicos para determinar MCs en agua y para el estudio de bioacumulación en tejidos animales. Sin embargo, es necesario complementar estas determinaciones con herramientas bioanalíticas que permitan detectar sus efectos tóxicos en forma sencilla. Para ello, se realizaron dos bioensayos utilizando “madrecitas de agua” (Cnesterodon decemmaculatus), especie nativa del Sur de Sudamérica, la cual representa una buena herramienta para evaluar la calidad ambiental de los recursos hídricos. Los bioensayos se realizaron con una floración de Microcystis sp. (conteniendo MCs entre 16 y 5500 µgL^-1) durante 96 horas (n=10 por duplicado de cada dosis). La concentración de MCs totales de la floración se analizó mediante ELISA y sus variantes químicas fueron identificadas por MALDI-TOF, detectándose mayoritariamente MCLR, acompañada por MCRR. Con los resultados del primer bioensayo (55-5500 µgMCsL^-1) se pudo estimar un valor CL₅₀ para esta floración (aprox. 1000 µgMCsL^-1). Los peces se fijaron para análisis histopatológico. Aún a concentraciones subletales, la histopatología mostró efectos notorios en diversos tejidos como edema branquial, alteración de la arquitectura del hígado, intestino con zonas de necrosis y pérdida de unión celular. Si bien se requieren mayores estudios, dado que es una especie presente en numerosos ecosistemas acuáticos,  estos resultados sugieren que C. decemmaculatus  tiene potencial como especie centinela de exposición a MCs.

Contacto: nbadagian@fq.edu.uy
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