Resumen:
La leptospirosis es una enfermedad bacteriana zoonótica causada por especies patógenas del género Leptospira. Existe muy poca información relacionada a la interaccion Leptospira/DC y la posterior generación de respuestas celulares T. Nosotros generamos bacterias recombinantes para el antígeno modelo OVA: una saprófita, L. biflexa Patoc-OVA (LBP-OVA), y una patógena, L. interrogans Manilae-OVA (LIM-OVA). Se realizaron ensayos de presentación de las bacterias por BMDCs murinas a células T CD4+ de ratones OT-II. Encontramos que, mientras LBP-OVA es capaz de inducir la proliferación y producción IFN-γ por linfocitos T CD4+, esta respuesta está abolida con LIM-OVA. Sugiriendo que la bacteria patógena es capaz de evitar su presentación a células T CD4+ y/o la proliferación de las mismas. Se demostró que ambas bacterias son capaces de inducir la maduración y producción de citoquinas por parte de BMDCs, y no afectan la proliferación de linfocitos T CD4+ en respuesta a BMDCs pulsadas con el péptido mínimo OVA reconocidos por los linfocitos T CD4+ OT2. Estos resultados sugieren que LIM podría impedir alguna etapa del procesamiento antigénico en la via del MHCII. Resultados de medida del pH fagolisosomal de BMDCs infectadas con las bacterias muestran que LIM es capaz de evitar la acidificación de este compartimiento, un mecanismo que evitaría su presentación y explicaría los resultados encontrados antes. Para profundizar estas observaciones utilizamos BMDCs Tmem176b-/-. Tmem176b es un canal ionico fagosomal que promueve la acidificación de este compartimento. Observamos que las BMDC Tmem176b-/- fallaron en inducir la proliferación de linfocitos T CD4+ OT2 cuando se infectaron con LBP-OVA. Ademas, estas BMDC no lograron acidificar el fagosoma conteniendo a LBP. Las especies patógenas de Leptospira podrían escapar de respuestas T CD4+ al manipular la acidificación fagosomal en DCs. 

Contacto: frammauro@pasteur.edu.uy
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Resumen:
Los vectores lentivirales (LVs) tienen un enorme potencial en medicina para corregir defectos genéticos, modificar o prevenir una enfermedad. En este caso se apunta a utilizar un modelo lentiviral de importancia en vacunas para ser utilizado como vehículo para el direccionamiento de antígenos a células presentadoras de antígeno (APCs). Para lograrlo, se mutan sitios específicos de las proteínas virales anulando su especificidad y se incorporan elementos de unión que confieren un nuevo tropismo. Si bien existen distintos sistemas de pseudotipado, uno que ha cobrado gran importancia últimamente es el pseudotipado con la envoltura viral de sarampión (MV), que consta de una proteína de fusión F y una proteína de unión H que ha sido mutada para eliminar su tropismo natural (Hmut). En este proyecto se propone dirigir el tropismo de LV-MV incorporando el dominio variable (nanobodies o VHHs) de anticuerpos carentes de cadena liviana de camélidos fusionados a Hmut. Actualmente se generaron LV-MV decorados con Hmut-VHH anti-CD11b, anti-CD11c, anti-MHCII y anti-toxina tetánica (control). Se ha optimizado su producción obteniendo títulos de 10⁷-10⁸ partículas virales/mL mediante RTqPCR. Se ha logrado la transducción dirigida mediada por nanobodies de células dendríticas derivadas de médula ósea y de la línea celular de macrófagos de ratón J774A.1. En general el porcentaje de transducción es bajo y variable respecto al pseudotipado (de amplia especificidad) obtenido con VSVg (proteína de envoltura del virus de la estomatitis vesicular) usado como referencia. A los efectos de mejorar la eficiencia de transducción, estamos optimizando distintas etapas en la generación de los LVs (relación de Hmut/F), controlándolas mediante citometría de flujo y hemos puesto a punto un ensayo para medir en tiempo real la unión de las partículas lentivirales pseudotipadas con VHHs al ligando correspondiente mediante interferometría de biocapa (BLItz).

Contacto: diegoperez@fq.edu.uy
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Resumen:
La atrazina es uno de los pesticidas más utilizados en todo el mundo y su monitoreo en el agua tiene implicancias relevantes para la salud humana. Nuestro grupo ha desarrollado inmunoensayos no competitivos usando péptidos que reconocen un inmunocomplejo formado por atrazina-anticuerpo monoclonal. Inicialmente los péptidos aplicados se encontraban representados en la superficie de partículas de fagos, pero debido a su carácter de reactivo biológico infectivo, recientemente, desarrollamos inmunoensayos no competitivos con péptidos libres de fagos. El nuevo reactivo lo denominamos Nanopeptámero y consistió en aplicar a los péptidos anti-inmunocomplejos de forma sintética, biotinilados y formando una estructura tetrámerica con estreptavidina. La tecnología “AlphaLisa” es una alternativa de ensayo homogéneo que puede ser aplicado a cualquier inmunoensayo en desarrollo como un formato rápido y automatizable. Se basa en un sistema comercial de dos beads, una aceptora y otra dadora, que generan una señal quimioluminiscente al encontrarse próximas y efectuar la transferencias de energía entre ellas. Durante el desarrollo del AlphaLisa, las beads conjugadas a los reactivos implicados en un inmunoensayo se aproximan al ocurrir el reconocimieno del analito permitiendo la transferencia de energía y consecuente generación de señal, la cual será proporcional a la cantidad de analito en muestra. En este trabajo, empleando la tecnología AlphaLisa desarrollamos un inmunoensayo homogéneo y no competitivo, para la detección de atrazina empleando un anticuerpo monoclonal antiatrazina y los Nanopeptámeros. El ensayo, que denominamos NanoAlphaLisa, permitió la detección homogénea de 0,3 ng/mL de atrazina en muestras de agua luego de sólo una hora de incubación. Dado que los límites aceptados de atrazina en agua potable son de 2 ng/mL, este ensayo puede ser una herramienta válida para el monitoreo de atrazina en aguas, aprovechando las ventajas de la automatización y el análisis de alto rendimiento que proporciona la tecnología AlphaLisa.                                                           

Contacto: glassabe19@gmail.com
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Resumen:
La transglutaminasa tisular (TG2) es una proteína multifuncional que participa en diferentes procesos celulares. Además está implicada en la patogenia de la enfermedad celíaca (EC) y otras patologías con componente inflamatorio. La TG2 tiene dos actividades principales: aciltransferasa (TGasa) y unión/degradación de GTP (GTPasa) que están mutuamente reguladas. Se ha reportado la expresión de variantes de splicing alternativo (v2, v3, v4a y v4b) que son versiones truncadas de la TG2 canónica (v1) en su región C-terminal y contribuyen a la diversidad funcional de esta enzima. Se analizó por qPCR la expresión de las variantes de TG2 en leucocitos humanos obtenidos de sangre periférica de individuos sanos y de pacientes celíacos. Los resultados muestran que se expresan todas las variantes con predominio de TG2v1 y TG2v2; este perfil también se observa en las fracciones de neutrófilos y linfocitos de ambos grupos. Al comparar la expresión de las variantes entre estos grupos de estudio, se observaron niveles significativamente superiores de TG2v1 en los pacientes e interesantemente también de TG2v3 (p=0.005 y p=0.009 respectivamente). Estas diferencias son independientes de la condición clínica de los pacientes (enfermedad activa versus remisión por dieta libre de gluten). En cambio, la mayor expresión de IL1 e IL6 en los leucocitos de pacientes en relación a los controles, parece reflejar el estado inflamatorio asociado a la EC. Los resultados sugieren que la regulación de la TG2 mediante el aumento relativo de la expresión de TG2v3 (que carece del dominio de unión a GTP y cuya actividad TGasa estaría desregulada) podría contribuir a la patogenia de la EC. Nuestro trabajo en marcha está orientado a descifrar los cambios inducidos en la función celular como consecuencia de la expresión diferencial de las variantes de TG2 en tejidos extraintestinales frecuentemente afectados por la EC.

Contacto: parbildi@higiene.edu.uy
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Resumen:
La larva del parásito  Echinococcus granulosus induce respuestas reguladoras. Nuestro grupo describió en este parásito una familia de proteínas Kunitz (EgKU) potencialmente secretadas, candidatas a contribuir a dicha regulación. EgKU1 y EgKU4, bloquean canales de potasio activados por voltaje (K_v), y con mayor afinidad, canales de sodio activados por pH ácido (ASICs). EgKU3, es un inhibidor de alta afinidad de quimotripsina, que bloquea solo marginalmente ASICs, y  en este trabajo incluimos como control. Los K_v regulan la activación convencional de células dendríticas y macrófagos en respuesta a agonistas de TLR, y el eflujo de potasio, a través de canales no identificados, es necesario para la activación del inflamasoma NLRP3. Por otra parte se ha demostrado recientemente que la acidosis extracelular, que en condiciones fisiopatológicas se genera en áreas inflamadas, activa  células dendríticas. Se propone que en esta activación participan los ASICs. Nuestro proyecto abarca el estudio de los efectos mediados por la actividad bloqueante de canales de EgKU1 y EgKU4  sobre la activación convencional, activación del inflamasoma NLRP3 y activación producida por acidosis extracelular en células dendríticas de ratón derivadas de médula ósea en presencia de GMCSF. En cuanto a activación convencional con un agonista de TLR (LPS) no se observaron efectos significativos. Para la activación del inflamasoma NLRP3 se observó inhibición marginal, poco reproducible, y presente en las tres proteínas Kunitz, lo que sugiere que los efectos no se deben al bloqueo de canales. En cuanto a la activación por acidosis, hasta el momento se reprodujeron los resultados publicados que informaban que  al exponer a las células a una disminución en el pH extracelular, se genera un aumento en la expresión de MHCII, y en menor grado de otras moléculas de superficie. Actualmente estamos evaluando posibles efectos inhibitorios de EgKU1 y EgKU4 sobre esta la activación por acidosis.

Contacto: csagasti@higiene.edu.uy
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Resumen:
En los Bancos de Leche Humana (BLH), la leche donada es sometida a la pasteurización de Holder (62.5°C/30minutos) para eliminar gérmenes patógenos.  Sin embargo, este procedimiento tiene efectos adversos sobre los componentes inmunológicos. Con el fin de optimizar la calidad de la leche, nos propusimos evaluar los efectos de dos métodos innovadores de pasteurización (Altas Presiones Hidrostáticas, APH; Ultra-Altas Presiones Hidrostáticas, UAPH), sobre los anticuerpos como principales componentes inmunológicos. Se procesaron en forma aséptica las muestras correspondientes a pooles de leche extraída por 5 donantes entre los días 13 y 90 post-parto.  Cada muestra fue pasteurizada por los tres métodos y al igual que la leche cruda, fueron conservadas a -80ºC hasta el análisis inmunoquímico. Se analizaron varias condiciones de temperatura y presión para cada método: 10-30ºC a 250-600MP para APH y 20°C a 200-300MPa para UAPH para establecer las condiciones óptimas. Los principales resultados obtenidos hasta el momento sugieren que los métodos de APH y UAPH presentan una mayor retención de anticuerpos respecto al método tradicional. Mediante la pasteurización de Holder, la IgA remanente fue del 64%, mientras que con los métodos alternativos se incremento a 99% en las condiciones óptimas (APH:20ºC/350MPa; UAPH:20°C/200MPa). En relación a IgM, con Holder se detectó un nivel de retención del 21%, mientras que con APH sorprendentemente se alcanzó una retención total (100%) en algunas muestras (20°C/350MPa), y del 85% con UAPH (20°C/200MPa).  Los procesos fueron validados con los controles microbiológicos que se realizan rutinariamente en los BLH. Los resultados observados permiten visualizar a ambos métodos, tanto APH como UAPH, como una alternativa posible para optimizar la calidad inmunológica de la leche procesada en BLH para su administración a niños prematuros.

Contacto: crodriguez@fq.edu.uy
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Resumen:
Los anticuerpos de cadenas pesadas (HCAbs), presentes en Camélidos, presentan un sitio de unión a antígeno que consiste en sólo 16 KDa y es denominado nanobody.  Como resultado de las características sobresalientes que presentan dichos anticuerpos, como por ejemplo altos rendimientos de expresión soluble en E. Coli, termoestabilidad y alta estabilidad fisicoquímica, han sido ampliamente utilizados como herramientas biotecnológicas. Debido a la importancia en generar herramientas de monitoreo para pequeñas moléculas tales como drogas, toxinas, pesticidas, a las que globalmente denominamos haptenos, la generación de nanobodies en esta línea es de gran interés. Actualmente, se han reportado varios ejemplos de nanobodies contra haptenos, si bien no siempre son interacciones de muy alta afinidad, hay ejemplos en donde reconocen a su analito con afinidades de orden nanomolar. Inicialmente se dudaba que el sitio de unión formado únicamente por 3 CDRs presente en los HCAbs fuera capaz de generar una hendidura hidrofóbica para acomodar al hapteno como sí sucede en los anticuerpos convencionales, donde el sitio de unión lo conforman 6 CDRs provenientes de las cadenas livianas y pesadas. Sin embargo, los nanobodies demostraron ser capaces de adoptar diferentes conformaciones con el fin de interactuar con pequeñas moléculas. En este trabajo, se resolvió la estructura cristalográfica de 2 nanobodies libres y en complejo con su antígeno, el antimicrobiano TCC. La forma de reconocimiento de dichos complejos mostró una interacción muy peculiar, descripta previamente como “Tunnel-like binding”, donde el sitio de unión a antígeno es un túnel formado principalmente por el CDR1 y una región en el FR3, denominada CDR4. Los residuos que presentan mayor participación en el reconocimiento del TCC visualizados en la estructura, resultaron ser fundamentales para la interacción nanobody-hapteno ya que la generación de mutantes en dichos residuos disminuyó drásticamente la afinidad de los anticuerpos por su antígeno.

Contacto: stabaresdarosa@fq.edu.uy
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