Resumen:
El antígeno carbohidrato Tn (GalNAc-O-Ser/Thr) se expresa en más del 90% de adenocarcinomas y constituye tanto una herramienta diagnóstica así como un blanco de inmunoterapias anti-tumorales. Trabajos previos demostraron que la presencia de Tn se asocia a la malignidad, y está vinculado con la capacidad de las células de generar metástasis. Sin embargo, hasta el momento no existe un modelo tumoral in vivo que haya investigado el papel tumorigénico de este antígeno. Por ello, en este trabajo generamos un modelo tumoral que nos permita investigar el papel del antígeno Tn en el crecimiento tumoral in vivo. En particular, se generó y caracterizó una línea murina de cáncer de pulmón (LL2) que expresa el antígeno Tn (LL2-Tn+), mientras que la línea parental no presenta dicha estructura (LL2-Tn-). Posteriormente, comparamos el crecimiento tumoral in vivo y la sobrevida de ratones singénicos inoculados con la línea parental LL2-Tn- y la LL2-Tn+. Se observó que los animales inoculados con las células Tn+ presentaron un crecimiento tumoral acelerado en comparación con aquellos inoculados con las células LL2-Tn-. Además los tumores Tn+ presentaron un mayor índice de vascularización. Por otro lado, los tumores Tn+ se caracterizaron por presentar mayores niveles de TNFa y TGFb que los tumores Tn-, y por reclutar células CD11c⁺ que expresan el receptor de lectina tipo C, MGL2, el cual puede interaccionar con el antígeno Tn y participar en procesos de inmunomodulación. Estos resultados indican la importancia del antígeno Tn en el proceso tumoral y sugieren que podría ser responsable de procesos inmunomoduladores desencadenados por las células tumorales.

Contacto: valeriadacosta@fmed.edu.uy
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Resumen:
El cáncer colorrectal constituye un serio problema de salud pública y en Uruguay representa  la segunda causa de muerte por cáncer en mujeres y la tercera en hombres. A pesar de que la detección precoz asegura un alto porcentaje de curación, hoy en día el 55% de los casos es detectado en etapas avanzadas. Actualmente, la detección de hemoglobina en materia fecal es la única prueba no invasiva recomendada para el tamizaje de cáncer de colon. La disponibilidad de herramientas de alta sensibilidad que permita un tamizaje masivo de población asintomática es indispensable. En base a estos antecedentes, hemos desarrollado un ELISA de tipo sándwich basado en el uso de nanobodies que permite  la detección temprana de hemoglobina (Hgb) humana en materia fecal. Los nanobodies son anticuerpos recombinantes monodominio, derivados del dominio variable de los anticuerpos de cadena pesada de camélido, que se destacan por su pequeño tamaño (15 kDa vs 150 kDa), gran estabilidad y facilidad de expresión en sistemas procariotas. Estas características los convierte en una prometedora alternativa a los anticuerpos monoclonales convencionales (IgG) para diseñar numerosas aplicaciones biotecnológicas. El par de nanobodies utilizado en este ensayo, se aisló a partir de una biblioteca de expresión en fagos filamentosos (phage display) utilizando un sistema de biotinilación in vivo acoplado a un método de high throughput lo cual permite evaluar  cientos de combinaciones para seleccionar los mejores pares para la detección de antígenos.  Con estas herramientas se desarrolló un ensayo de bajo costo, carente de reactividad con hemoglobinas dietarias,  altamente estandarizable, con excelente sensibilidad y recuperación analítica en muestras adicionadas con cantidades conocidas de hemoglobina.  

Contacto: delfintriana@gmail.com
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Resumen:
La leucemia linfoide crónica (LLC) es el tipo más común de leucemia en adultos en los países occidentales. Clásicamente se ha descrito que los linfocitos B leucémicos son resistentes a la apoptosis. Sin embargo, otros tipos de muerte programada no han sido explorados en profundidad en esta patología. Los inflamasomas son complejos intracelulares que responden a señales de estrés activando caspasa-1, lo que puede desencadenar un tipo de muerte celular programada llamada piroptosis. En este trabajo, encontramos que células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) de pacientes progresores presentan menos células B con caspasa-1 activa comparado con pacientes indolentes y donantes sanos. Este porcentaje aumenta con el tiempo de cultivo, correspondiendo a células que además presentan la membrana permeable y GSDMD. Además, en células de pacientes progresores la inhibición de caspasa-1 utilizando el inhibidor Ac-YVAD-CMK disminuye la muerte celular. Esto sugiere que en la LLC progresiva la activación de caspasa-1 puede desencadenar un tipo de muerte celular compatible con la piroptosis. TMEM176A y TMEM176B son canales intracelulares descritos por nuestro grupo como nuevos reguladores del inflamasoma. Encontramos que TMEM176A estaría presente en las células B tumorales y su sobre-expresión estaría asociada a progresión. Además, demostramos que TMEM176A es capaz de regular la activación de caspasa-1 en la LLC, ya que su silenciamiento aumenta el porcentaje de células B con caspasa-1 activa. De manera interesante, drogas inhibidoras de la actividad de canal ionico deTMEM176A indujeron la muerte de células B leucémicas de manera dependiente de caspasa-1. En base a estos resultados, proponemos que la LLC progresiva podría controlar la activación de caspasa-1, a través de la sobre-expresión de TMEM176A, y esto sería beneficioso para la progresión de la enfermedad ya que impediría la muerte de las células tumorales.

Contacto: frammauro@pasteur.edu.uy
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Resumen:
La capa laminar (CL) es la estructura acelular que delimita la larva del parásito cestode Echinococcus granulosus. La CL, constituida por mucinas y depósitos de myo-inositol hexakisfosfato (InsP₆) cálcico, ofrece una gran superficie de interacción al sistema complemento del hospedero. Esta superficie podría activar en particular a la vía clásica (VC), ya que la CL resulta opsonizada por anticuerpos. La molécula de reconocimiento de la VC, C1q, es una de las principales proteínas de suero humano retenidas sobre InsP₆ cálcico sintético.  En este trabajo se analizó si la misma interacción ocurre en el contexto de la CL y si impacta sobre la activación de la VC. Se trabajó con suspensiones de CL, nativas o pre-tratadas con EDTA para eliminar selectivamente al InsP₆ cálcico, y con InsP₆ cálcico purificado. Se observó que la CL efectivamente retiene C1q, en forma selectiva y mayoritariamente dependiente del InsP₆ cálcico. Si bien el InsP₆ cálcico purificado activa a C1r, C1s, y C2, el aporte del compuesto a dicha activación en el contexto de la CL es pobre o nulo. Esto sugiere que el InsP₆ cálcico compite por C1 con los anticuerpos pero activa C1 más pobremente que éstos. Además, aún en condiciones en las que el InsP₆ cálcico aporta a la activación de C1, el compuesto no contribuye a la activación a nivel de C5, biológicamente más importante. Determinamos que esto se debe a que la activación iniciada sobre el InsP₆ cálcico se continúa de forma también ineficiente a nivel del depósito covalente C4 y C3, coherente con la falta de grupos nucleofílicos en el InsP₆. Estos resultados nos llevan a especular que el papel del InsP₆ cálcico podría ser presentar en forma multivalente a C1q para inducir perfiles anti-inflamatorios en las células fagocíticas en la vecindad del parásito.    

Contacto: ltcgrzz@gmail.com
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Resumen:
En los últimos años se han establecido en Uruguay varios emprendimientos de acuicultura dedicados a la cría de esturión (Acipenser spp.). La granja “esturiones del Río Negro”, pionera en este rubro, cría principalmente esturiones rusos (Acipenser gueldenstaedtii) obteniendo caviar de excepcional calidad. A pesar del éxito de este emprendimiento, durante los meses de verano ocurre un aumento en la mortalidad de los esturiones. Nuestro grupo pudo determinar que las elevadas temperaturas de verano constituyen un factor de estrés fundamental que afecta componentes claves del Sistema Inmune Innato y repercute negativamente en el crecimiento de estos peces. Esta situación nos ha motivado a desarrollar herramientas que permitan evaluar el estado sanitario de los esturiones y mediante su implementación disminuyan las pérdidas económicas. A tales efectos, el desarrollo de inmunoensayos para detectar en suero posibles marcadores asociados al estrés térmico y a infecciones resulta una solución promisoria debido a su robustez y fácil implementación. Con este objetivo, mediante un análisis bioinformáticao se diseñaron cebadores que permitieron amplificar e identificar la secuencia de varias proteínas de fase aguda (PFA) y de respuesta al estrés térmico (PET) del esturión ruso. Posteriormente, se evaluaron los niveles de expresión relativa de estos candidatos mediante PCR en tiempo real en hígados de esturiones rusos inoculados con Aeromonas hydrophila o con tampón salino. Los resultados demostraron que la proteína amiloide A sérica (SAA) fue la que aumentó mayormente sus niveles relativos de ARNm. A continuación, el gen de la SAA se clonó en múltiples vectores para su expresión recombinante en E. Coli, lográndosela obtener en forma soluble y en grandes cantidades al fusionarla a las proteínas MBP y TRX. Actualmente se está optimizando su purificación para luego producir anticuerpos específicos que permitan detectar la SAA en muestras de suero mediante inmunoensayos.

Contacto: mauricaste@gmail.com
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Resumen:
La acuicultura de esturión en Uruguay ha crecido notoriamente durante las últimas décadas, convirtiendo a nuestro país en uno de los principales productores de caviar en el mundo. No obstante, durante los meses cálidos los esturiones sufren infecciones bacterianas recurrentes que impactan en la producción. Así, la consolidación de este sector productivo requiere el desarrollo de herramientas para monitorear y fortalecer el estado sanitario de los esturiones. Debido al limitado conocimiento sobre la respuesta inflamatoria de esta especie, estas herramientas son casi inexistentes. La proteína amiloide P del suero (SAP) pertenece al grupo de las proteínas de fase aguda, utilizadas como marcadores para la detección temprana de procesos inflamatorios en varios vertebrados. Nos interesó entonces analizar si la SAP podría funcionar de esta manera en el esturión. Obtuvimos una fracción enriquecida en SAP mediante cromatografía de afinidad de suero de esturión sobre agarosa (Sepharose-2B) en presencia de calcio, confirmando su identidad mediante electroforesis bidimensional acoplada a espectrometría de masas. Para valorar el potencial de la SAP como marcador inflamatorio ajustamos un ensayo para su detección en suero por Western Blot usando anticuerpos policlonales de conejo anti-SAP de esturión producidos en nuestro laboratorio. Observamos que los niveles séricos de SAP en esturiones estimulados con bacterias inactivadas disminuyeron significativamente a las 24hs post-estimulación (~30%, ANOVA). Una tendencia similar se observó a las 72hs post-estimulación (~50%), aunque sin alcanzar significancia estadística. Apoyando estos resultados, los niveles de ARNm de SAP en hígado, determinados mediante qPCR, también mostraron una tendencia a la disminución (~30%) en peces estimulados respecto a sus controles. Globalmente, los resultados sugieren que la SAP se comporta como una proteína de fase aguda negativa en esturión, por lo cual no representaría un marcador inflamatorio ideal, aunque podría ser de utilidad si se valorara en conjunto con proteínas de fase aguda positivas.

Contacto: marivalsil@gmail.com
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Resumen:
El microambiente de la exposición antigénica en el intestino neonatal incide sobre el desarrollo de respuestas inmunes adecuadas durante la edad adulta y condiciona el desarrollo de patologías con componente inmunológico. La leche materna contribuye con la generación del microambiente adecuado para el establecimiento de la tolerancia oral aportando moléculas inmunomoduladoras y anticuerpos específicos contra proteínas dietarias, entre otros factores. Estas propiedades podrían estar alteradas en la Enfermedad Celíaca, patología inflamatoria caracterizada por la ruptura de la tolerancia a proteínas del gluten (gliadinas); los efectos protectivos de la lactancia para su desarrollo en hijos de madres celíacas es aún controversial. En este contexto estudiamos la composición de leche madura de madres celíacas en dieta libre de gluten y de mujeres sanas con dieta no restrictiva; analizando 27 y 42 muestras extraídas en el primer año. El análisis longitudinal mostró perfiles similares en relación a la disminución de proteínas y aumento de IgG con el tiempo de lactancia; los niveles de IgA e IgM se mantuvieron constantes así como los macronutrientes (grasas y lactosa). Los aportes de IgA (0,27 vs 0,4 mg/ml) e IgM (1,2 vs 5,1 µg/ml) fueron inferiores en las leches de madres celíacas (p=0,0056 y 0,010 respectivamente), y en ambos casos las diferencias fueron más evidentes en la lactancia tardía (>6 meses); en contraste, los niveles de IgG fueron comparables. Al analizar la fracción de anticuerpos específicos contra gliadina, la leche de madres celíacas mostró niveles superiores de IgA (115,4 vs. 39,3 UA/ml; p=0,0009) y menores de IgG específicos (0,0875 vs. 0,21 UA/ml; p=0,0004). Las diferencias observadas en el aporte de componentes inmunológicos potencialmente implicados en el desarrollo de tolerancia oral podrían ser significativos en la programación inmunológica del neonato y son la base de futuros estudios.

Contacto: emi.villamil@gmail.com
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Resumen:
A partir de un barrido de alanina de la región 32-51 de la proteína antimicrobiana LALF (Limulus anti-LPS factor) se desarrolló un péptido sintético CIGB-552. Este péptido no une LPS y demostró tener capacidad de penetración en líneas celulares, presentar toxicidad selectiva en líneas tumorales y aumentar la sobrevida de animales portadores de tumores. Tras exponerlo a suero murino, el péptido mostró un patrón de degradación produciendo metabolitos de menor tamaño (10, 14 y 17aa). Por otro lado, la proteína COMMD1 fue validada como posible blanco de acción del CIGB552 y se demostró que inhibe la vía NF-kB, factor que promueve la expresión de genes implicados en la supervivencia celular, inflamación y oncogénesis. Bajo la hipótesis que el CIGB552 actúa sobre COMMD1 inhibiendo la activación de la vía NF-kB, en este trabajo estudiamos los efectos anti-inflamatorios producidos por el péptido y los metabolitos derivados en modelos celulares y animales, a fin de comprender su rol en la biología tumoral. Para el abordaje in vitro hemos generado líneas celulares humanas de origen tumoral (HT-29, H460 y T47D) reporteras para la vía de NF-kB. Las células fueron transfectadas establemente con el plásmido pNF-kB-hrGFP y se evaluó por citometría de flujo la capacidad del CIGB552 y los metabolitos de modular este factor tras un estímulo inflamatorio. Para los estudios in vivo se empleó el ratón transgénico NFkB-RE-luc, modelo de inflamación sistémica donde se observa la activación de la vía del NFkB tras un estímulo inflamatorio a través de la medida de luminiscencia registrada mediante un sistema de in vivo imaging. En los modelos in vitro el CIGB552 fue capaz de modular la vía de NFkB, no así los metabolitos derivados. Experimentos en curso aportarán evidencias del efecto de CIGB552 in vivo.

Contacto: hdaghero@pasteur.edu.uy
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Resumen:
El antígeno B (EgAgB) es la principal lipoproteína (~230 kDa) producida por la larva (hidátide) del parásito Echinococcus granulosus s.l.. Sus apolipoproteínas están codificadas por una familia multigénica y polimórfica perteneciente a una familia de proteínas exclusiva de cestodos con capacidad de unir ligandos hidrofóbicos. En el hospedero, la hidátide induce una respuesta inmune tipo Th2 modificada, caracterizada por un fuerte componente regulador. Diversos trabajos sugieren que el EgAgB modula la inflamación asociada a la activación de células innatas y contribuye a inducir un perfil tipo Th2. Sin embargo, en dichos trabajos se utilizaron preparaciones que no son representativas del EgAgB en su estado nativo. Para estudiar el efecto del EgAgB nativo sobre las células innatas se purificaron las partículas lipoproteicas a partir de líquido hidático siguiendo protocolos previamente optimizados. La caracterización de estas partículas mediante SDS-PAGE y DLS mostró que constituyen una población homogénea. Se estudió luego el efecto del EgAgB sobre macrófagos, estimulando macrófagos humanos THP-1 con varios agonistas de PRR, en presencia o ausencia de EgAgB, y analizando la secreción de IL-1β e IL-6 por ELISA. El EgAgB nativo fue capaz de inhibir la secreción de ambas citoquinas pro-inflamatorias inducida por LPS y zymosán, pero no mostró efectos sobre la secreción inducida por mananos, Pam3 y PoliI:C, sugiriendo diferencias en su capacidad de influenciar vías de activación mediadas por diferentes PRRs. Por otro lado, en estos ensayos el EgAgB nativo indujo per se secreción de IL-1β e IL-6 de forma dosis-dependiente, pero no se ha podido discriminar si esto representa un efecto intrínseco  del EgAgB o deriva de pirógenos (contaminantes derivados de la purificación y difíciles de eliminar dadas la propiedades bioquímicas del EgAgB). Para responder esta pregunta se está trabajando actualmente en la expresión recombinante de las apolipoproteínas del EgAgB en células de insecto.

Contacto: sofialm93@gmail.com
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