Resumen:
La cicatrización de una herida requiere de la coordinación de varios procesos celulares: migración, proliferación y muerte programada de las células cicatriciales. Uno de los eventos de señalización que ocurre durante la cicatrización de una monocapa celular es una onda fugaz de calcio (OFCa), la que se inicia instantáneamente luego de realizada una herida. Hemos previamente encontrado que, en células de endotelio de córnea de bovino en cultivo (BCEC), la inhibición de la OFCa tiene escaso efecto sobre la migración. En este trabajo mostramos que, durante la cicatrización de BCEC, ocurren dos etapas de apoptosis caspasa dependiente. La primera es independiente de la distancia migrada, tiene un máximo a las dos horas de realizada la herida y finaliza aproximadamente a las seis horas. En la segunda etapa, evidenciable a partir de las seis horas, la tasa de apoptosis es directamente proporcional a la distancia migrada. Por otra parte, nuestros resultados indican que la inhibición reversible de la OFCa reduce la tasa de proliferación (~30%) pero incrementa la tasa de apoptosis (~100%). Además, hemos encontrado que la inducción de un incremento de calcio similar a la OFCa mediante la incubación con ATP restaura los valores control de proliferación y apoptosis. Resultados más recientes de nuestro laboratorio sugieren que las oscilaciones de calcio exhibidas por algunas células  durante la OFCa dependen de la concentración de ATP liberado al medio extracelular. Hemos asimismo observado que la inducción de un incremento de la frecuencia de oscilaciones de calcio provoca una reducción de aproximadamente 50% en la tasa de apoptosis durante la primera etapa de muerte celular, sin afectar la segunda. En su conjunto, nuestros resultados indican que, durante la cicatrizacion en BCEC, la OFCa participa en el desencadenamiento de la proliferación celular y en el control de la apoptosis excesiva.

Contacto: cjustet@fmed.edu.uy
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Resumen:
En células musculares esqueléticas de rana cargadas con Mag Fluo4 AM estudiadas bajo control de voltaje en doble trampa de vaselina luego de 2 horas a temperatura ambiente para permitir la remoción de la forma aniónica del indicador presente en el citoplasma  las señales de Ca²⁺ de Mag Fluo4 se originan en el retículo sarcoplasmático (RS). La medida simultánea de señales de Ca²⁺ de origen citoplasmático reportadas por el indicador Rhod2 agregado a la solución intracelular como sal de K permitió estudiar el poder amortiguador de Ca²⁺ del RS que es aproximadamente constante en el rango de cambio de Ca²⁺ libre (≤0.1 mM)  durante un pulso a 0 mV durante 100 ms. El estudio del acoplamiento excito-contractor (AEC) con un indicador en el RS permite revisitar el efecto de amortiguadores de Ca²⁺ extrínsicos aplicados a alta concentración citoplasmática, experimento controversial debido a la competencia entre el amortiguador y el  indicador citoplasmático. Por estar en distintos compartimientos indicador y amortiguador no compiten, por ello los cambios en la señal fluorescente son debidos exclusivamente a modificación de la liberación de Ca²⁺ desde el RS. Se comparó el efecto de 40 mM EGTA con 20 mM BAPTA, soluciones con igual poder buffer de equilibrio pero por su kon 100 veces mayor BAPTA tiene una distancia de captura 7 veces menor. Ambos amortiguadores reducen el Ca²⁺ libre de reposo del RS de 0.4 a 0.1 mM. BAPTA disminuye significativamente la cantidad de Ca²⁺ liberado por una depolarización de 200 ms, sugiriendo una inhibición de la permeabilidad de Ca²⁺ de la membrana del RS. Simulaciones de AEC con un modelo de dos compartimentos (citoplasma y RS) reproducen razonablemente las observaciones asumiendo una importante disminución de la permeabilidad en presencia de BAPTA. Financiado por PEDECIBA.

Contacto: folivera@fmed.edu.uy
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Resumen:
En células musculares esqueléticas sin membrana superficial (mecánicamente removida) la aplicación de una solución con alta [Ca²⁺] suprime la liberación de Ca²⁺ producida por despolarización de los túbulos transversos resellados. En esta preparación el estado del sensor de voltaje (SV) no puede ser estudiado. Aquí reportamos el efecto de la [Ca²⁺] intracelular (Cai) elevada sobre el acoplamiento despolarización-contracción en células de músculo de rana con su membrana intacta bajo control de voltaje. Cai se aumentó por: 1) aplicación directa en la solución intracelular, 2) por un ionóforo de Ca²⁺  que facilita su ingreso desde el medio extracelular, 3) por la movilización farmacológica del Ca²⁺ desde el retículo sarcoplasmático (RS). La función de los SV, estimada por el movimiento de carga (MC) se redujo al 57.6+7.1 % del valor de referencia, el flujo de liberación de Ca²⁺ (FL) al 15.6+2.7 %. En las células donde se liberó farmacológicamente el contenido de Ca²⁺ del RS se redujo al 54.7+6.9 %. La reducción del FL corregida por la reducción del contenido y del MC fue al 55.2+5.6 % del valor de referencia  sugiriendo que la mitad de los SV que permanecen funcionales están desacoplados de los canales de liberación que normalmente controlan. Este efecto  es comparable al reportado en fibras fatigadas y apoya un rol del aumento de Cai en la fatiga. Leupetina, un inhibidor de calpaínas, aplicado intracelularmente previno los efectos descriptos. En el 40 % de las fibras desacopladas la liberación de Ca²⁺ perdió el estricto control por el voltaje de membrana (Vm): Cai continuó subiendo por centenas de milisegundos luego de repolarizado Vm a su valor de reposo sugiriendo que los canales desacoplados son activados por otro mecanismo, probablemente por Ca²⁺. Financiado por CSIC y PEDECIBA.  

Contacto: gpizarro@fmed.edu.uy
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Resumen:
En el músculo esquelético, el módulo sensor de voltaje (VSM) del canal de Ca²⁺, Cav_1.1, presenta la particularidad de controlar dos procesos: la corriente de Ca²⁺ de membrana (I_Ca) y la liberación de Ca²⁺ intracelular a través de los receptores de rianodina (RyR) del retículo sarcoplasmático. Su respuesta a los cambios de potencial de la membrana puede ser monitoreada registrando los movimientos de carga una vez bloqueadas las corrientes iónicas. A su vez este proceso se correlaciona con la liberación de Ca²⁺ intracelular. El  estudio de estos procesos permitió avanzar en la comprensión del acoplamiento excitación-contracción (AEC) en el músculo esquelético, fundamentalmente en músculo de anfibio. En este trabajo mostramos que las propiedades del sensor de voltaje del AEC en el mamífero son cualitativamente similares a las de la rana. A potenciales despolarizados, la liberación de Ca²⁺ se encuentra totalmente inactivada y se acompaña de un desplazamiento de la distribución de carga hacia voltajes más negativos. Estos cambios pueden ser interpretados en base a un modelo de 4 estados del VSM similar al utilizado en el anfibio donde se proponen dos estados activados y dos estados inactivados. Las transiciones entre estos estados producen dos especies de carga, denominadas carga 1 y cara 2, que se interconvierten en función del potencial de membrana. Se realizaron experimentos en donde se midió la inactivación de la liberación de Ca²⁺ en forma simultánea con la de I_Ca en respuesta a cambios del potencial de mantenimiento de la membrana. Los resultados obtenidos permiten especular sobre la estequiometria funcional entre el VSM y el RyR. Financiado por CSIC, ANII  

Contacto: gbrump@gmail.com
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