Resumen:
Los camélidos además de los anticuerpos convencionales producen anticuerpos carentes de cadena liviana (sdAbs) en los que el sitio de unión al antígeno está formado únicamente por el dominio variable de 15 kDa de la cadena pesada (VHH). Debido a la ausencia de ”barajado” de las cadenas livianas y pesadas, el aislamiento de VHHs a partir de bibliotecas de expresión en fagos es más sencilla que en el caso de anticuerpos convencionales. Por otro lado, los VHHs se expresan con alto rendimiento en forma recombinante (nanobodies), tienen propiedades únicas de solubilidad y estabilidad, y constituyen versátiles dominios de especificidad para la construcción de quimeras, o chaperones para cristalización de proteínas. Con solo 3 CDRs la diversidad estructural del sitio de unión es menor que en los anticuerpos convencionales, pero esto no parece limitar su capacidad de reconocimiento y se han aislado nanobodies de alta afinidad contra todo tipo de antígenos. Una excepción parcial a lo anterior es el caso de las moléculas pequeñas (haptenos), que típicamente se unen a cavidades formadas en la interface de las cadenas livianas y pesadas en los anticuerpos convencionales. En esta presentación discutiremos estas propiedades de los nanobodies con ejemplos de aplicaciones llevadas adelante por nuestro grupo.

Contacto: ggonzal@fq.edu.uy
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Resumen:
La activación de receptores acoplados a la proteína G (GPCRs) resulta en la generación de  segundos mensajeros como AMP cíclico (AMPc) y GMP cíclico (GMPc). Esto promueve una cascada de eventos pleiotrópicos a nivel intracelulares cuyo resultado final depende de la adecuada compartimentalización de las señales dando lugar a circuitos funcionales de información. En dicho contexto, conocer la correcta discriminación espacio-temporal versus la distribución global de estos segundos mensajeros permitiría aumentar la especificidad de potenciales fármacos y reducir sus efectos adversos. Para ello es imprescindible entender la organización estructural que determina la función y regulación de los compartimientos individuales de cada segundo mensajero. Disecar estas vías de señalización requiere de procedimientos no invasivos y en tiempo real en células o tejido vivo. Por estos motivos, frecuentemente se emplean técnicas espectroscópicas para monitorear el cambio de fluorescencia por efecto FRET de sensores moleculares.Estos sensores están típicamente constituido por un modulo proteico capaz de ligar AMPc/GMPc generando una transición alostérica y una pareja de variantes espectrales de la proteína fluorescente verde (GFP) que cambian su orientación y distancia relativa como resultado del mecanismo alostérico. Usando una estrategia racional que combina bioinformática, modelado molecular, simulaciones de grano grueso, biología molecular y experimentos de fluorescencia, hemos desarrollado una nueva generación de sensores FRET (llamado CUTie) con una arquitectura innovadora, formada por dos módulos fluorescentes anidados en un dominio de plegamiento mínimo de unión al ligando que deja el extremo N-teminal libre para la fusión a otra proteína. CUTie permite detectar concentraciones de nucleótidos cíclicos intracelulares con una resolución sin precedentes, gran selectividad e independencia de sensibilidad al compartimiento que sea dirigido. Este avance tecnológico abre el campo de posibilidades para la ingeniería de nuevos sensores con distintas afinidades y potencial multifunción al poder acoplar diferentes módulos efectores a una sola molécula.

Contacto: fklein@pasteur.edu.uy
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Resumen:
La enfermedad de von Hippel-Lindau (VHL) es un desorden hereditario, autosómico dominante que predispone a la formación de una variedad de quistes y tumores benignos y malignos en diversos órganos. El gen de VHL es un supresor tumoral que codifica para una proteína (pVHL) la cual, integrada al complejo multiproteico VBC, determina la poliubiquitinación y posterior degradación por el proteasoma de las subunidades α del factor inducible por hipoxia (HIFα). Si bien en los últimos años se han descripto otras funciones de pVHL independientes de HIF y relevantes para el desarrollo tumoral, la regulación del nivel de subunidades HIFα sigue siendo su función mejor caracterizada.Tras demostrar mediante ensayos in vivo la patogenicidad de dos variantes de pVHL (P138R y L163R) caracterizadas por nuestro grupo se buscó analizar in silico su estructura y dinámica para contribuir al conocimiento de los mecanismos moleculares subyacentes. Se emplearon herramientas de modelado computacional (campo de fuerza clásico AMBER) para predecir estructura e interacciones proteína-proteína y proteína-solvente en complejos VBC-HIF (PDBID 1LQB) de cada variante P138R/L163R comparada a pVHL nativa bajo condiciones quasi-fisiológicas (caja de agua explícita TIP3P y contraiones, NPT a 310 K y 1 atm). La termodinámica de la interacción VBC-HIF fue también caracterizada usando la aproximación MM/PB(GB)SA.La estabilidad relativa de los complejos VBC-HIF formados con ambas variantes resultó ser menor que con pVHL nativa. Aun así, estos complejos se forman in vitro. Analizada la accesibilidad de Lys blanco de modificaciones postraduccionales determinantes de la estabilidad y funciones HIF independientes de pVHL, se detectaron diferencias que deben ser confirmadas in vitro. Los resultados obtenidos, sientan base para futuros estudios tendientes a determinar la implicancia de las modificaciones estructurales aquí caracterizadas in silico en los procesos de degradación y modificación de pVHL.

Contacto: cmatho@fcien.edu.uy
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Resumen:
HemR, de Leptospira, es un regulador de respuesta de la familia de proteínas OmpR/PhoB y controla el metabolismo del hemo, esencial para estas bacterias. Tras su activación por fosforilación, mediada por la histidin-quinasa HemK, HemR actúa como un regulador transcripcional dual: induce la expresión de genes codificantes para enzimas involucradas en la síntesis de hemo, e.g. el operón hemA, probablemente reclutando a la ARN polimerasa (ARNP); y simultáneamente reprime la expresión de proteínas catabólicas de degradación de hemo, e.g. el operón hmuO, impidiendo estéricamente la asociación de la ARNP al promotor. El operón hmuO (o hol) codifica entre otras para la hemo oxigenasa, un factor de virulencia en Leptospira patógenas. El objetivo de este trabajo consiste en desacoplar la regulación dual de HemR mediante mutagénesis dirigida en su bucle de transactivación, permitiendo su unión al ADN pero impidiendo el reclutamiento de ARNP. Los residuos mutados fueron seleccionados en base a alineamientos secuenciales y estructurales entre HemR y PhoB, y análisis estructurales de los complejos PhoB:ADN y ARNP:ADN, siguiendo una estrategia de diseño racional. Las variantes de HemR se expresaron en Escherichia coli y se purificaron por cromatografía de afinidad y exclusión molecular. La unión de los mutantes a los promotores hemA y hmuO fue confirmada por ensayos de retardo de movilidad electroforética. Inesperadamente, algunos mutantes se unieron al ADN incluso desfosforilados. Estos constructos mutados están siendo clonados junto a su promotor nativo en un vector “shuttle” para conjugar desde E. coli en una cepa knockout hemR^- de Leptospira biflexa. La expresión de los promotores será determinada por RT-PCR. Este trabajo contribuye a entender los mecanismos moleculares que aseguran la conexión estímulo-respuesta en el metabolismo del hemo, íntimamente ligado a la patogenicidad de Leptospira.  

Contacto: juanimelio@pasteur.edu.uy
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Resumen:
Las Ciencias de la Vida están viviendo una nueva revolución: poder ir desde la observación de detalles moleculares y sus interacciones, hasta su integración en mecanismos funcionales de organismos vivos. La Biología Estructural ha contribuido con estructuras 3D y propiedades bioquímicas de una enorme diversidad de moléculas biológicas. Hoy caminamos hacia enfoques sistémicos, integrando escalas temporales y espaciales de mayor magnitud. En este trabajo discutiré ejemplos de nuestro laboratorio, combinando aproximaciones complementarias para estudiar motilidad en bacterias.  La motilidad es esencial en quimiotaxis, nutrición, y también en la diseminación de bacterias patógenas. Elegimos el género Leptospira como modelo singular de locomoción. Estas Espiroquetas poseen sólo dos flagelos, determinantes de la morfología celular y de su capacidad de natación. En contraste con sistemas ampliamente estudiados, los flagelos de Leptospira no son extracelulares, sino que rotan confinados en el espacio periplásmico. Nuestros resultados revelan que la composición proteica del flagelo de Leptospira es inusualmente compleja. Centrando nuestro análisis en el filamento (prolongación que sobresale del motor y el gancho conector), además de la flagelina, hemos identificado varias proteínas adicionales. Las “flagellar coiling proteins” Fcp A y B [1], esenciales para la motilidad traslacional, y para la virulencia de especies patógenas. También se reclutan dos isoformas de FlaA, conservadas en todas las Espiroquetas. Resolvimos las estructuras cristalográficas de FcpA [2] y FcpB, que sorprendentemente revelan dos nuevos plegamientos proteicos, ausentes en la PDB. Estamos obteniendo mapas de densidad 3D por crio-tomografía electrónica de filamentos enteros de Leptospira, en los cuales podremos ajustar las estructuras cristalográficas. El filamento flagelar de Leptospira parece ser un ensamblaje supramolecular con marcada asimetría, lo que nos conduce a hipótesis nuevas sobre el mecanismo de natación de Espiroquetas.   [1] Wunder, Mol Microbiol (2016) 101:457-70. [2] San Martín, Acta Crystallogr F (2017) 73:123-9.

Contacto: alebus@pasteur.edu.uy
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