Resumen:
In virtually all cells the nucleus is positioned at a specific location. Disruption of nuclear position affects cell division, polarity, and migration and is associated with numerous diseases.  We use wounded fibroblast and myoblast monolayers as model systems to study the mechanisms of nuclear movement and positioning. We identified a novel nuclear adhesive structure composed of the LINC (linker of nucleoskeleton and cytoskeleton) complex proteins nesprin-2G and SUN2 that attaches the nucleus to actin cables to move the nucleus. As with cell-cell and focal adhesions, we find that this nuclear adhesion is reinforced by the binding of other proteins, including the actin bundling proteins FHOD1 and fascin.  Importantly, we find that the interaction of nesprin-2G with FHOD1 stimulates its actin bundling activity, suggesting that the nucleus actively participates in reorganizing the actin cytoskeleton. Mutations in LINC complex components and lamin A/C, which anchors the LINC complex, cause muscular dystrophies, lipodystrophies, ataxias and progeria. Using our model system, we find that expressing the disease variants of these proteins results in defects in nuclear positioning, cell polarization and migration. Interestingly, the defects in nuclear movement and cell polarization observed in progeria patient fibroblasts are also observed in fibroblasts from normal individuals over age 60. Treatments that reduce progeria expression or its abnormal farnesylation restore normal nuclear movement and cell polarization in both progeria and aged fibroblasts suggesting a common determinant for premature and normal aging.

Contacto: ggg1@cumc.columbia.edu
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Resumen:
Los nitroalquenos derivados de ácidos grasos poliinsaturados (NO₂FA) son mediadores lipídicos, producidos endógenamente en contextos inflamatorios, capaces de modular la activación de varios tipos celulares. Esto resulta de su acción sobre distintas vías de señalización asociadas a la inflamación y al metabolismo lipídico. Entre otras, los NO₂FA activan receptores nucleares de la familia PPAR, particularmente la isoforma PPARγ. Este trabajo buscó elucidar qué mecanismos moleculares y eventos celulares están ligados a la activación de PPARγ por NO₂FA. Primeramente, demostramos que los NO₂FA activan PPARγ en monocitos/macrófagos ya que indujeron la expresión de genes reporteros de PPARγ (la proteína de unión a ácidos grasos FABP4 y el receptor barrendero CD36) en forma dependiente del receptor (anulada por GW9662, inhibidor específico de PPARγ). Como FABP4 participa en el transporte intracelular de ácidos grasos, evaluamos si esta proteína podía unir y transportar NO₂FA al núcleo, contribuyendo a la activación de PPARγ. Utilizando ensayos de desplazamiento competitivo de una sonda fluorescente, encontramos que in vitro los NO₂FA son capaces de unirse a la FABP4 con una afinidad levemente menor que la de sus precursores no nitrados (µM). Esto podría permitir su unión a la FABP4 así como también su disociación frente a otro interactor con afinidad por el NO₂FA, como PPARγ. Finalmente, utilizamos un inhibidor de FABP4 (BMS309403) para evaluar su papel en la activación de PPARγ mediada por NO₂FA. Observamos que la activación de PPARγ por NO₂FA fue interferida por el BMS309403 sugiriendo que FABP4 contribuye a dicha activación, posiblemente actuando como proteína transportadora. Actualmente estamos analizando por inmunofluorescencia el efecto de los NO₂FA sobre la distribución celular de FABP4. Globalmente nuestros resultados plantean que los NO₂FA podrían autorregular su transporte intracelular en monocitos/macrófagos a través de la inducción de una proteína capaz de transportarlos, FABP4, promovida por activación de PPARγ.

Contacto: mlamasber@gmail.com
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Resumen:
A nivel mundial la preocupación por el sobrepeso y la obesidad toma cada vez más relevancia y Uruguay no es ajeno a esta problemática. Ambos, constituyen el principal factor de riesgo para el desarrollo de diabetes tipo II, enfermedades cardiovasculares y Síndrome Metabólico. Los orígenes de estas patologías incluyen la generación de resistencia a insulina y una inflamación sistémica crónica y estéril, donde el tejido adiposo (TA) presenta un estado disfuncional y proinflamatorio. Los principales contribuyentes al estado patológico del tejido son los preadipocitos, con un fuerte componente secretor proinflamatorio y células inmunes que infiltran el tejido, retroalimentando positivamente la respuesta inflamatoria. Nuestro grupo propone que SIRT6, una desacilasa de histonas que se encuentra unida a la cromatina, podría tener un rol en la respuesta inflamatoria. Presentaremos resultados in vitro e in vivo relacionados con la expresión, distribución, regulación y actividad enzimática de SIRT6 en respuesta a estímulos proinflamatorios. Los estudios in vitro incluyen el estudio de macrófagos, células con fenotipo secretor senescentes y preadipocitos. Los in vivo consisten en el estudio de la respuesta de células inmunes peritoneales a infecciones agudas así como e estudio del TA de ratones bajo dietas hipercalóricas. Finalmente, se presentarán resultados concernientes a la respuesta de SIRT6 frente a la administración de compuestos antiinflamatorios. Los resultados indican que SIRT6 aumenta su expresión en respuesta a estímulos proinflamatorios y al fenotipo secretor senescente, siguiendo el patrón de expresión de citoquinas proinflamatorias. Esta respuesta es inhibida en presencia de compuestos antiinflamatorios. Sin embargo, a pesar de existir un aumento en la expresión de SIRT6 durante la inflamación, observamos una inhibición en su actividad desacetilasa a nivel nuclear. Nuestros resultados in vitro e in vivo  sugieren que en respuesta a un estimulo proinflamatorio, SIRT6 se relocaliza intracelularmente, indicando un redireccionamiento respecto a su función clásica.    

Contacto: mbresque@pasteur.edu.uy
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Resumen:
Nc886 es un transcripto de ARN no-codificante de 102 pb inicialmente clasificado como un precursor de microARN (Pre-miR-886), más tarde como un homólogo divergente de los vault ARNs (vtRNA2-1) y recientemente como un nuevo tipo de ARN no-codificante (nc886). La identidad de nc886/vtRNA2-1/Pre-miR-886 sigue siendo controvertida; se evidenció una regulación epigenética y función supresora de tumor y oncogénica en diferentes cánceres. Aquí presentamos por primera vez, el estudio de nc886 en el cáncer de próstata. La metilación del promotor de nc886 se encontró aumentada en el tumor frente al tejido prostático normal, así como en el tejido metastásico frente al tejido prostático normal. Adicionalmente, la metilación del promotor nc886 correlacionó con la clínica del cáncer de próstata, incluyendo recurrencia bioquímica, valor T clínico y score de Gleason. Observamos una disminución de nc886 en el tumor frente a tejido normal, concordante con el estado de metilación del promotor, y un aumento del mismo al ser tratado con agentes desmetilantes. De hecho, la metilación de nc886 mostró correlación con la expresión de DNMT3B. En estudios funcionales, la sobreexpresión de nc886 en DU145 condujo a una disminución en la proliferación celular in vitro debido a una acumulación de células en fase G2/M del ciclo celular, así como a una reducción del crecimiento celular in vivo en xenoinjertos de tumor en ratones NUDE. La expresión de nc886 mostró correlación con una firma de genes asociada a la progresión del ciclo celular en el cáncer de próstata. En resumen, nuestros datos sugieren un papel supresor de tumor para nc886 en la próstata, cuya expresión es epigenéticamente silenciada en el cáncer, conduciendo a un aumento de la proliferación celular. Nc886 podría presentar valor clínico en el cáncer de próstata dada su asociación con parámetros clínicos y con una firma génica clínicamente validada.

Contacto: rafaelfort20@gmail.com
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Resumen:
Similarly to humans, in which obesity is related to a variety of age-related diseases, the lifespan of laboratory rodents is limited by obesity, including that promoted by ad libitum eating of a standard chow diet. Indeed, daily limitation of caloric intake (calorie restriction) has been widely shown to enhance lifespans and prevent age-related diseases in rodents. We will discuss the metabolic differences between caloric restriction and other dietary interventions that promote weight loss, such as intermittent fasting. We will also show how mitochondrial form and function are altered in caloric restriction, and how changes in energy metabolism promoted by this dietary intervention prevent age-related diseases and modifications in the brain, liver, skin b-cells and stem cells. Overall, our results show that caloric intake, mitochondrial form and function are intimately interconnected, and present central regulatory roles in age-related diseases.

Contacto: alicia@iq.usp.br
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Resumen:
Introducción Las enfermedades mitocondriales (EM) son enfermedades multisistémicas producidas por defectos en la fosforilación oxidativa que se pueden presentar a cualquier edad y con un muy amplio espectro de síntomas y signos. La mayoría de las mutaciones que causan disfunción mitocondrial están en el ADN nuclear, y un 10% en el propio genoma mitocondrial. Se presenta, a partir de un caso clínico, el análisis de la patogenicidad de una mutación en el ADN mitocondrial.   Caso clínico y análisis molecular Niña de 3 años, hija de una pareja sana, no consanguínea. Sin patología perinatal. Desarrollo normal hasta los dos años, cuando comienza con caídas frecuentes, signos motores piramidales y distónicos a derecha a predomino crural. Resonancia magnética con alteraciones a nivel de núcleos grises de la base y de las fibras corticoespinales en mesencéfalo, y pico de lactato en la espectroscopía. Lactato en líquido cefalorraquídeo aumentado. El resto de los estudios del metabolismo fueron normales.   Se realizó la secuenciación del genoma mitocondrial en sangre periférica. Se detectó una mutación de cambio de sentido (3697A (G131S) en el gen ND1) con una heteroplasmia alta (0.99), una clasificación de polyphen2 como “probably damaging”, en un locus compatible con el fenotipo. La misma estaba presente con baja heteroplasmia en su madre (0,16 en sangre y 0,53 en orina) y su hermana mayor sana (0,24 en sangre y 0,16 en orina). Esta mutación ha sido descrita previamente como patogénica y se ha demostrado su efecto deletéreo sobre la función proteica y mitocondrial.   Comentarios. El diagnóstico de las enfermedades mitocondriales es complejo, requiriendo de estudios clínicos, genéticos y metabólicos. El mismo es importante para guiar el tratamiento apropiado, ofrecer un pronóstico y para el asesoramiento genético.

Contacto: vraggio@yahoo.com
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Resumen:
El melanoma es un cáncer muy agresivo cuya incidencia ha aumentado en las últimas décadas. La senescencia es un punto final de la quimioterapia y terapias dirigidas en el melanoma y el fenotipo secretor asociado a la senescencia (SASP) puede afectar el crecimiento y microambiente tumoral. Trabajos previos muestran que el metabolismo energético puede modular el SASP y está involucrado en la resistencia del melanoma a la terapia. En este trabajo estudiamos el metabolismo energético de células de melanoma de ratón B16-F1 tras la inducción de la senescencia por el quimioterapéutico temozolomida. La exposición a temozolomida activó la respuesta al daño del ADN, aumentó los niveles de p53 y p21 e inhibió la proliferación. Además, aumentó la actividad β-galactosidasa, el tamaño celular y la expresión génica de componentes del SASP. El tratamiento indujo la senescencia en aproximadamente un 60 % del cultivo. La inducción de la senescencia fue acompañada por un aumento en varios parámetros respiratorios: el consumo de oxígeno mitocondrial basal, ligado a la síntesis de ATP y máximo; la eficiencia de acoplamiento, capacidad de reserva y el índice de control respiratorio. La evaluación de la actividad citrato sintasa, el marcado con la sonda mitocondrial Mitotracker y la relación ADNmt/ADNn revelaron un aumento en la masa mitocondrial. Las células senescentes presentaron mitocondrias más alargadas y alteraciones en los niveles y localización de las proteínas Fis1 y Drp1, evidenciando alteraciones en la fisión mitocondrial. Por último, los estudios en células senescentes aisladas basándose en el tamaño celular y utilizando el inhibidor de p53 pifithrin-α, confirmaron que el aumento en la bioenergética mitocondrial se asociaba específicamente a la senescencia. Nuestros resultados indican que la inducción de la senescencia del melanoma por temozolomida promueve una reprogramación p53-dependiente del metabolismo energético, que involucra alteraciones en la masa y dinámica mitocondrial.

Contacto: jennymartinez20@gmail.com
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Resumen:
Los cestodos de la familia Taeniidae son los más importantes desde el punto de vista médico y veterinario. En particular, nuestra región es altamente endémica para la hidatidosis quística, causada por Echinococcus granulosus. Resulta de sumo interés comprender mejor la biología de este parásito, los factores que favorecen su establecimiento y su relación con el hospedador. Entre otros aspectos interesantes de su metabolismo se destacan los relacionados a la homeostasis del hierro, en particular, la provisión de centros ferrosulfurados (Fe/S) a enzimas esenciales. Específicamente, son de nuestro interés las proteínas Grx5 e IsTRP. Grx5 es una glutarredoxina mitocondrial monotiólica de clase II, conservada en eucariotas y vinculada a la maquinaria de síntesis de Fe/S. Sin embargo, sólo las Grx5 de platelmintos parásitos poseen una inserción de ocho aminoácidos en un sitio inusual del plegamiento tiorredoxina, así como un residuo extra de cisteína (C102) en el extremo C-terminal de la hélice alfa que contiene el sitio activo. Para comprender mejor su mecanismo de unión a Fe/S, se analizaron proteínas recombinantes mutadas en las regiones exclusivas de platelmintos parásitos (Δ8, C102S y Δ8-C102S) mediante técnicas cromatográficas y espectroscopia UV-visible. Si bien con variaciones, todas unen Fe/S. IsTRP, por su parte, es una proteína relacionada a tiorredoxina (TRP) capaz de unir Fe/S de forma independiente de glutatión, codificada únicamente en el genoma de cestodos del orden Cyclophyllidea, con un sitio activo canónico CxxC, y sin actividad óxidorreductasa. Datos transcriptómicos de E. multilocularis indican que IsTRP se transcribe en el adulto grávido y muy poco en otros estadios, por lo que podría cumplir algún rol en el establecimiento del parásito en su hospedador intermediario. Se observó que IsTRP es capaz de transferir Fe/S a una ferredoxina aceptora y se está buscando profundizar sobre su perfil de transcripción.

Contacto: jlporfido@pasteur.edu.uy
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Resumen:
La regulación de la síntesis proteica es un mecanismo clave en el control de la expresión génica, en particular en células neuronales donde la intrincada morfología que éstas pueden alcanzar aporta un grado mayor de complejidad. Considerando que pocos reguladores traduccionales proteicos nuevos han sido descritos para neuronas, en la presente tesis, nos propusimos estudiar el papel de PDCD4 (Programmed Cell Death 4), un regulador del inicio de la traducción, que nuestro grupo ha observado se expresa en altos niveles en neuronas del SNC y SNP. Para esto, utilizamos la metodología Ribosome Profiling sobre un modelo celular neuronal (PC12) donde silenciamos la expresión de PDCD4 de manera inducible (shARN en vectores lentivirales). En este contexto, identificamos al menos 480 ARNm cuya eficiencia traduccional aumenta al disminuir la expresión de PDCD4. Los blancos putativos encontrados fueron estudiados mediante análisis de ontología, para conocer las principales funciones celulares reguladas por dicho factor, donde se destacan funciones asociadas a la mitocondria (fosforilación oxidativa, cadena de transporte de electrones y producción de energía), así como procesos asociados a la sinapsis, ribosoma y síntesis proteica. El análisis individual de ciertos genes, nos indicó que potencialmente PDCD4 podría estar influenciando el crecimiento neurítico, lo cual fue verificado fenotípicamente en células PC12 diferenciadas: en ausencia de PDCD4, las neuritas presentaban un largo promedio 1,6 veces mayor. Estos resultados, nos permiten plantear una influencia negativa de PDCD4 sobre la neuritogénesis. En suma, pensamos que PDCD4 puede estar cumpliendo funciones neuronales asociadas a diversos contextos fisiológicos definidos ampliamente como plásticos. En cada uno de ellos el repertorio de ARNm regulados por PDCD4 dependerá del conjunto de genes disponibles en dicho contexto. Este es un terreno a explorar en el futuro, incluyendo la determinación de las señales secundarias y terciarias que median la interacción de PDCD4 con sus blancos.

Contacto: g.eastman.roge@gmail.com
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Resumen:
Trypanosoma cruzi and different species of Leishmania are obligate intracellular parasites that are members early-branching group of unicellular eukaryotes responsible for diseases that affect over 20 million people and cause countless infections in other mammals. T. cruzi is the causative agent of Chagas disease, which affects mainly the heart and gastrointestinal tract, whereas more than 20 different species of Leishmania cause Leishmaniasis, a human disease with manifestations ranging from cutaneous ulcerations to fatal visceral infection. Studies by several groups have identified trans-sialidase surface proteins as essential for T. cruzi infection and for the parasite capacity to survive in the host bloodstream whereas amastin genes have been identified as virulence factors essential for the intracellular survival of both T. cruzi and Leishmania amastigotes inside the host cell. By knocking-down the expression of amastins in L. braziliensis, we showed that these proteins are essential for early stages of the infection of mouse macrophages and may be directly involved in the establishment of the tight contact that is observed between the surface of amastigotes and the membrane of the parasitophorous vacuole of the infected macrophage. By performing comparative genomic and transcriptomic analyses between virulent and avirulent strains of T. cruzi we showed evidences indicating that trans-sialidases plays and an essential role during the last steps of the intracellular infection, being involved, together with other cell surface proteins, in the last steps of the differentiation process between amastigotes to the infective, bloodstream trypomastigotes. By developing new protocols for RNA interference and genome editing in T. cruzi and Leishmania we are now able to perform more deep investigations in the role of these large surface protein multigene families present in the genomes of these parasite.

Contacto: santuzat@ufmg.br
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Resumen:
Fernando Alvarez-Valin. 

Contacto: fernandogav@gmail.com
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Resumen:
La meiosis es un proceso incluido en la espermatogénesis, y consiste en una duplicación de ADN seguida de dos divisiones celulares consecutivas, dando como resultado células haploides. La profase I de la meiosis se divide en 5 etapas: leptoteno, cigoteno, paquiteno, diploteno y diacinesis. Estudios previos (Soumillon y cols., 2013) predijeron que el testículo de mamífero es el tejido que presenta mayor número de ARNs largos no codificantes (lncRNAs). Sin embargo, hasta la fecha no se ha profundizado en su identificación. En nuestro laboratorio se ha puesto a punto una nueva metodología para la obtención de fracciones celulares espermatogénicas con altísimo nivel de pureza que incluye por primera vez profase meiótica temprana (lepto/zigoteno). Se trata de clasificación celular por citometría de flujo basada en contenido de ADN (y otros parámetros) utilizando el colorante vital Vybrant Dye Green, de unión estequiométrica al mismo. Esta metodología nos permitió purificar las siguientes fracciones celulares de testículo de ratón: 2C [espermatogonias (células pre-meióticas) y células somáticas], LZ (leptoteno/zigoteno), PS (paquiteno) y RS (espermátidas redondas, post-meióticas). A partir de las cuatro fracciones, por triplicado, extrajimos ARN total de excelente calidad y construimos bibliotecas para secuenciación masiva. Empleamos un kit comercial que permite baja cantidad de ARN de partida ya que amplifica la muestra, y construye librerías direccionales (hebra-específicas). Los resultados de la secuenciación indicaron que las réplicas son altamente reproducibles. Los datos de secuenciación están siendo analizados mediante distintas herramientas bioinformáticas, y los resultados preliminares muestran que existe un alto número de lncRNAs detectados en las diferentes etapas estudiadas. En este trabajo presentamos una comparación de estos lncRNAs y sus principales características, incluyendo expresión diferencial entre etapas, origen autosómico o en el par sexual, localización en la hebra sentido o antisentido, entre otras. Financiación: ANII-FCE-1-2014-1-104251.

Contacto: mafertro@gmail.com
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Resumen:
Gracias a los avances realizados en los últimos años en técnicas de amplificación de ARNs y accesibilidad a las plataformas de secuenciación y análisis de datos, es posible plantearnos estudiar la composición de transcriptos presentes en axones de neuronas. En los últimos años se han publicado una decena de transcriptomas axonales. Una característica común de estos trabajos es que utilizan cultivos neuronales para la obtención de los mismos. Esto tiene como grandes desventajas que las neuronas en cultivo cambian su expresión génica en forma significativa, dado que se encuentra respondiendo al daño, en regeneración activa y desprovistas de su microambiente natural. Mediante la utilización de la técnica de microdisección de axones in toto, hemos logrado identificar y cuantificar los transcriptos presentes tanto en axones motores como sensoriales, provenientes de ratas adultas. Al analizar los transcriptos encontrados en todos los sets de datos se observa que hay una baja coincidencia en cuanto a la identidad de los mismos. Sin embargo, cuando analizamos las categorías ontológicas enriquecidas en cada uno se observa que están conservadas, siendo las más enriquecidas aquellas relacionadas al ribosoma, fosforilación oxidativa, enfermedades neurológicas, entre otras. Al comparar los transcriptomas de axones maduros con los de axones en cultivo, encontramos grandes diferencias en cuanto al número de transcriptos localizados en este dominio subcelular, encontrándose un mayor número en los axones en cultivo. Esto se puede deber a que los axones en cultivo se encuentran desprovistos de su microambiente, y células accesorias. En los transcriptomas de axones maduros encontramos algunas diferencias en abundancia de transcriptos, centrándonos en el estudio de los ARNm codificantes para proteínas ribosomales. Analizar los datos de los transcriptomas de axones disponibles nos permitió encontrar un set de transcriptos comunes a todos ellos, como también identificar las particularidades de cada axón proveniente de distintos tipos de neuronas.

Contacto: joaquinafarias@gmail.com
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Resumen:
La trypanosomiasis Americana es una enfermedad crónica y endémica que afecta a millones de personas principalmente en Latinoamérica. Trypanosoma cruzi, su agente causal, tiene un ciclo de vida que involucra transiciones morfológicas y funcionales complejas así como la adaptación a distintos tipos de ambientes. Estas transiciones requieren una regulación estricta de la expresión génica, la cual es alcanzada en este organismo mediante regulación post-transcripcional. En este trabajo, realizamos el primer análisis transcriptómico por RNAseq de los tres principales estadios de vida del parásito: amastigotas, epimastigotas y tripomastigotas. Este análisis nos permitió delinear los perfiles transcriptómicos de cada estadio así como identificar aquellos procesos biológicos de mayor relevancia en cada estadio. El estudio de expresión estadio específico nos permitió evidenciar la plasticidad de T. cruzi a adaptarse rápidamente a condiciones diferentes, con un foco particular en la remodelación de proteínas de superficie y cambios metabólicos durante el ciclo. Los epimastigotas, que se replican en el intestino del insecto vector, mostraron una mayor expresión de genes relacionados al metabolismo energético aeróbico, principalmente ciclo de Krebs, cadena respiratoria y fosforilación oxidativa, así como también genes relacionados con la síntesis de esteroides y metabolismo de nucleótidos. En este estadio también se evidenció una subexpresión de genes que codifican glicoproteínas de superficie. Los tripomastigotas, que se encuentran en el torrente sanguíneo del hospedero mamífero expresan un gran repertorio de genes que codifican  glicoproteínas de superficie y proteínas de señalización involucradas en la invasión y evasión de la respuesta inmune. Los amastigotas por último, que se encuentran dentro de las células de mamífero, expresan mayoritariamente genes que codifican transportadores de membrana y proteínas reguladoras del ciclo celular. Este estadio también expresa un subgrupo específico de genes codificantes de proteínas de membrana. Por último, estos resultados permitieron mejorar la anotación del genoma de la cepa Dm28c.

Contacto: chiribao@pasteur.edu.uy
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Resumen:
La soja (Glycine max), un cultivo altamente demandante de nitrógeno, puede obtener este nutriente por fijación biológica de nitrógeno (FBN) cuando se asocia simbióticamente con bradirizobios. Esta asociación resulta de una comunicación a nivel molecular entre microorganismos y plantas, y lleva a la formación de nódulos radicales donde ocurre el proceso de FBN. Los flavonoides exudados por las raíces, cumplen un rol clave en el inicio de este diálogo molecular, desencadenando la producción de factores de nodulación por los rizobios (y finalmente la formación de nódulos).  Nuestros objetivos fueron evaluar el efecto de pre-incubar bradirizobios con flavonoides sobre la nodulación y el rendimiento de soja en condiciones de invernáculo, y la sobrevivencia de los bradirizobios sobre las semillas inoculadas. Las semillas se inocularon con Bradyrhizobium elkanii U1301 y U1302 crecidos en presencia y ausencia de flavonoides. Se cosecharon plantas en tres estadios de crecimiento: cuarto nudo (V4), floración completa (R2) y madurez fisiológica (R8). En V4 y R2 se analizó el peso seco (PS) de parte aérea (PA) y raíz, el largo de PA, y número y PS de nódulos. En R8 se analizó la biomasa aérea, el número y peso de chauchas y granos, e índice de cosecha. Los datos se sometieron a análisis estadístico. Se observó que el agregado de flavonoides no afecta la adherencia ni sobrevivencia de los bradirizobios sobre las semillas, y que incrementa la biomasa aérea seca y el número y PS de nódulos en raíces secundarias de plantas en R2. En R8 produjo un mayor número de chauchas y granos, en relación a las semillas inoculadas con bradirizobios sin pre-tratamiento. Estos resultados sugieren que algunos metabolitos involucrados en la comunicación microorganismo-planta pueden ser útiles para la mejora de los inoculantes tradicionales. Agradecimientos y financiación: PIEP (MIEM) y LAGE y Cía. S.A.

Contacto: braulioriviezzi94@gmail.com
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Resumen:
Los procesos de lodos activados en tratamientos de efluentes para depurar aguas residuales se ven ocasionalmente afectados por el crecimiento excesivo de bacterias filamentosas, lo cual trae inconvenientes asociados al esponjamiento de lodos como bulking y formación de espumas o foaming. Esto afecta negativamente las propiedades del lodo causando pérdida de sólidos. Las bacterias filamentosas pueden pertenecer a grupos taxonómicos diversos, entre ellos el filo Chloroflexi. En nuestro país no se conoce cuáles son las causantes de problemas en lodos activados. El objetivo de este trabajo fue caracterizar las bacterias filamentosas presentes en tres sistemas de tratamiento de aguas residuales: maltería, bebidas no alcohólicas y residuos hospitalarios. Para ello se analizaron muestras de lodos activados por microscopía de contraste de fases e Hibridación in situ fluorescente (FISH) utilizando sondas dirigidas al filo Chloroflexi. Se realizó  secuenciación masiva del gen de ARNr 16S lo cual se está analizando actualmente con QIIME. La morfología y abundancia de flóculos y de filamentosas fueron diferentes en las diferentes muestras. En las de maltería se distinguieron 2 tipos de filamentos; unos largos y curvados formando puentes interfloculares, y otros rectos y cortos. Para bebidas no alcohólicas se observaron filamentos cortos y rectos en el flóculo y en su superficie. Y para residuos hospitalarios se observaron filamentos torcidos y enrollados en el flóculo y libres. Utilizando FISH se detectó presencia de Chloroflexi en todas las muestras. Sin embargo, para residuos hospitalarios se detectó una alta abundancia mientras que para los otros reactores, la cantidad de Chloroflexi fue mucho menor comparando con la abundancia de otros filamentos. Nuestros resultados indican que las bacterias filamentosas son diferentes en los diferentes reactores. Se debe continuar con los estudios para poder relacionar los problemas de sedimentación con el sobrecrecimiento de algún tipo de filamento. Esto permitiría desarrollar estrategias de control.

Contacto: maru.gcr@gmail.com
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Resumen:
El H₂ es un combustible limpio que se puede producir de manera biológica, mediante fermentación de materia orgánica por microorganismos anaerobios. La eficiencia del proceso depende de la prevalencia de los microorganismos productores de H₂ sobre los competidores y los consumidores del mismo. Modificando varios parámetros de operación en reactores hidrogenogénicos se ha logrado evitar la metanogénesis, pero no la homoacetogénesis. Ambos procesos consumen H₂ y bajan el rendimiento de producción. Se ha reportado que la homoacetogénesis predomina en reactores con densidad celular (DC) alta. La DC de un CSTR es proporcional al tiempo de residencia celular (TRC). Nuestro objetivo fue relacionar la homoacetogénesis con la inestabilidad de producción de H₂ en CSTR operados a diferentes TRC. Se operaron tres CSTR a TRC 6,10 y 24 horas. Se inocularon con lodo metanogénico, tratado térmicamente. El lodo tratado fue aclimatado mediante operación semi-batch, con alimentación sintética a base de glucosa (15gDQO/L). Para la operación en modo continuo su concentración fue 30gDQO/L. Los CSTR se operaron por 20 TRC, pH y temperatura constantes (5,5 y 37ºC, respectivamente). Se monitoreó la producción de biomasa, de ácidos orgánicos y de H₂. La comunidad microbiana fue analizada por T-RFLP del gen del ARNr de 16S realizado a partir del ADN y del ARN (ADNc). Los homoacetógenos se cuantificaron mediante q-PCR del gen de la THFS. La producción de H₂ fue inestable en todas las operaciones. No se encontró una correlación entre los períodos de baja producción de H₂ y la presencia de microorganismos homoacetogénicos. Este resultado es concordante con las concentraciones de acetato encontradas en las operaciones. El metabolito mayormente producido, fue el lactato, por lo que la producción inestable de H₂ podría deberse a la competencia de los microorganismos productores de H₂ con bacterias lácticas y no a la prevalencia de bacterias homoacetogénicas.

Contacto: luciabraganan@gmail.com
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Resumen:
Se espera que las comunidades microbianas involucradas en la producción y oxidación de metano, principales contribuyentes a las emisiones de metano en ambientes naturales, se vean fuertemente afectadas por el aumento de temperatura ya observado (y previsto para el futuro) en los ecosistemas de alta latitud, lo que eventualmente resultará en un feedback que incrementará las emisiones de metano. Con el fin de investigar este efecto se tomaron muestras líquidas y sólidas en 9 puntos de muestreo diferentes en el estado de Alaska en julio de 2016. Como primer paso, se realizaron varios análisis físico-químicos, tales como temperatura, pH, mediciones de sólidos volátiles, cationes y aniones, trazas metálicas, así como extracciones de ADN y ARN. Posteriormente, con el objetivo de evaluar la capacidad de producir metano de estos ecosistemas, se realizaron ensayos de actividad metanogénica para cuatro temperaturas diferentes (5°C, 10°C, 15°C y 20°C). Se determinó la producción de metano midiendo la presión generada y midiendo la concentración en el biogás mediante cromatografía gaseosa. Los resultados preliminares muestran que las muestras de la turbera 1, lago 1 y 4 presentaron una producción más rápida de metano que los otros ecosistemas. Para este conjunto, la producción máxima de metano se logró más rápidamente a 20°C, entre 3 a 5 semanas, mientras que a 5°C se observó la producción máxima en un período comprendido entre 14 y 18 semanas. Los resultados permitirán evaluar el impacto del cambio climático sobre las emisiones de gases de metano en un ambiente sumamente vulnerable como el Artico. Este trabajo es parte de un proyecto global en donde se estudiará las emisiones de metano en muestras obtenidas de los alrededores de Punta Arenas en Chile y de una región de Siberia en Rusia.

Contacto: brunamadell@gmail.com
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Resumen:
En Uruguay se producen alrededor de 53.000 toneladas de manzanas siendo el principal destino el mercado interno para consumo en fresco. Estas permanecen largos períodos de tiempo almacenadas, surgiendo problemas con patógenos fúngicos como el Penicillium expansum. El uso de polímeros naturales como antifúngicos ha cobrado interés debido a la necesidad de reducir el impacto al medioambiente y salud humana que provocan los fungicidas sintéticos convencionales. El quitosano es un derivado de la quitina (compuesto natural encontrado en el exoesqueleto de artrópodos y segundo polímero natural más abundante) y se han reportado su capacidad antifúngica y de formación de films. En este estudio se evaluó la actividad antifúngica in vitro de quitosano de dos pesos moleculares contra Penicillium expansum así como su capacidad de formar films. Se determinó la inhibición del crecimiento micelial mediante ensayos con quitosano incorporado en PDA en concentraciones 10, 5 y 2,5mg/mL. En el centro de cada placa se sembró un disco de micelio del hongo y se incubó a 25ºC durante 7 días y se determinó el diámetro de crecimiento. Se observó entre 22 y 42% de inhibición del crecimiento micelial para ambos quitosanos. También se evaluó la inhibición de la germinación de esporas, empleando quitosano en concentraciones entre 0,01 y 0,25mg/mL, siendo esta última concentración la que logró una total inhibición de la germinación para ambos pesos moleculares de quitosano. Se elaboraron films de las dispersiones de quitosano de concentración 10 mg/mL mediante la técnica de casting. Para estos films se determinó la solubilidad en agua, contenido de humedad y permeabilidad al vapor de agua, observándose diferencias significativas entre los quitosanos de diferente peso molecular. En base a estos resultados resulta interesante profundizar en los ensayos in vivo en fruta para determinar su posible uso como fungicida.

Contacto: earrarte@fq.edu.uy
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Resumen:
El monitoreo microbiológico del agua con herramientas sensibles que aseguren la identificación de patógenos y sus capacidades patogénicas/tóxicas con alta especificidad asegura el mantenimiento de niveles de calidad adecuados. Actualmente, la detección se basa en cultivos y microscopía contando con claras limitaciones. Los avances en la detección de patógenos y sus regiones de patogenicidad/toxicidad, mediante nuevas técnicas genómicas, apoyan a las técnicas ya aceptadas por organismos de validación nacionales e internacionales. Este trabajo se enmarca en el desarrollo de una herramienta basada en el uso de multiplex PCR y secuenciación masiva capaz de detectar múltiples bacterias nocivas, en forma simultánea, en muestras de agua de ecosistemas acuáticos de nuestro país. Primariamente, nuestro ensayo se focalizó en el diseño de primers sobre regiones conservadas de 73 genes claves, vinculados a 46 regiones de patogenicidad y/o toxicidad perteneciente a más de 15 géneros bacterianos potencialmente patógenos. Dichas regiones se seleccionaron en base a criterios de conservación (análisis comparativo/evolutivo) que definen bloques conservados. En primer lugar, utilizando la secuencia de proteínas de referencia disponible en la base datos de GenBank, se realizó la búsqueda por similitud en base a un criterio mínimo de identidad (≥ 95%) y de cobertura (≥70%). Posteriormente se realizó el alineamiento en base a secuencias (tblastn) y la extracción de bloques conservados mediante la herramienta Gblocks. Para los 73 genes blanco, fue posible identificar al menos un bloque conservado, estos bloques de secuencias conservadas serán base para el diseño de primers del sistema PCR multiplex de Ampliseq. El desarrollo futuro de una herramienta capaz de caracterizar el perfil de patogenicidad/toxicidad bacterianos en muestras de agua, permitirá obtener información fundamental para establecer el grado de contaminación, seguir la evolución del nivel de toxicidad o inferir el posible origen de la misma entre otras aplicaciones.

Contacto: alvarogvet@gmail.com
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Resumen:
Rhizoupus stolonifer y Botrytis cinerea son hongos fitopatógenos involucrados em um grn número de enfermidades em poscosecha de frutos. El control de estos hongos se realiza actualmente por aplicación masiva de fungicidas. Sin embargo, la búsqueda de métodos alternativos de control se intensifica y dentro de ellos el uso de sustâncias “GRAS” se presenta como uma alternativa eficaz debido a sus efectos fungistáticos o fungicidas sobre fiotpatógenos. El objetivo de este trabajo consistió en estudiar el efecto de cuatro sustancias “GRAS” (bicarbonato de sódio, carbonato de calcio, cloruro de calcio e cloruro de potasio) en el control de crecimiento de R. stolonifer y B. cinerea. Los fitopatógenos se cultivaron em médio PDA suplementado con 1%, 1,5% y 3% de cada una de las sustancias GRAS citadas, excepto en el caso de cloruro de potasio para el cual se utilizaron concentraciones de 0,1%, 0,5% y 1%, conforme al limite adoptado por FAO/FDA como suplemento de alimentos. Luego 7 días de incubación el diámetro del micelio fue medido y comparado com un controle positivo. Los ensayos se realizaron por triplicado. De las cuatro sustâncias analizadas solamente el bicarbonato de sódio resultó efectivo como inhibidor in vitro del crecimiento de los fitopatogenos. Se obtuvo 100% y 60% de inhibición de R. stolonifer en presencia de 3% (BS) y 1,5% de (BS), respectivamente. Con B. cinerea se obtuvieron resultados semejantes, ocurriendo 100% de inhibición en medio suplementado com 3% (BS) y 60% de inhibición en meio suplementado con 1,5% (BS). Las restantes substâncias “GRAS” no fueron capaces de reducir o inhibir el crescimento micelial de los fitopatógenos. El bicarbonato de sódio resultó eficiente em el control de los fitopatogenos estudiados y se presenta como uma posible alternativa para el control de estos hongos.

Contacto: morganna_ferreira@hotmail.com
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Resumen:
La digestión anaerobia es el proceso por el cual la materia orgánica es oxidada hasta metano, potencial fuente de energía renovable. Diversos estudios han identificado un grupo de microorganismos presentes en todos los reactores formado por: Chloroflexi, Proteobacteria, Bacteroidetes y Firmicutes. El filo Chloroflexi también ha sido reportado como grupo predominante, particularmente la clase Anaerolineae. Por su morfología filamentosa se ha propuesto un posible rol en la formación de gránulos en reactores UASB, pero su sobrecrecimiento podría estar relacionado con procesos de bulking. A pesar de ser frecuentemente reportados en reactores anaerobios, su rol no está claro debido a que hay muy pocos representantes cultivados. En nuestro laboratorio, se estudiaron mediante secuenciación masiva del gen de ARNr 16S, 5 reactores UASB escala real, donde el filo Chloroflexi presentó una abundancia relativa entre 2 y 33%. La mayoría de las secuencias fueron clasificadas dentro de la clase Anaerolineae¸ las OTUs predominantes formaron un cluster con secuencias de miembros no cultivados detectados en otros trabajos. El objetivo del presente trabajo es determinar en diferentes UASB qué grupos dentro del filo Chloroflexi están presentes, cual es su abundancia relativa y si existe un grupo que esté presente en todo los reactores. Se realizará la búsqueda en bases de datos de secuencias del gen de ARNr de 16S obtenidas mediante secuenciación masiva de reactores UASB y se analizarán mediante la plataforma QIIME, focalizando el análisis en el filo Chloroflexi. Las secuencias mas abundantes serán utilizadas para análisis filogenéticos con el programa MEGA 7. Hasta el momento, se realizó el diseño y puesta a punto del análisis de secuencias obtenidas de Illumina mediante la plataforma QIIME. Este estudio contribuirá en la determinación de la diversidad y abundancia del filo Chloroflexi en UASB escala real, para comprender su rol en estos sistemas de tratamiento.

Contacto: patricia.bovio@gmail.com
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Resumen:
La intensificación en el uso del agua ha llevado a la pérdida de calidad de este recurso dando lugar a serios problemas ambientales, de salud y económicos en todo el mundo. Es necesario alcanzar óptimas condiciones ecológicas en los cursos de agua para asegurar su uso saludable y sustentable. Algunos microorganismos presentes en el agua son causantes de toxicidad y/o patologías severas, por lo que su monitoreo es fundamental. A causa de la eutrofización ocurren episodios de floración de los órdenes Chroococcales, Oscillatoriales y Nostocales, potencialmente tóxicas en cuerpos de agua dulce y estuarios marinos. Actualmente se acepta que la diversidad bacteriana heterótrofa acuáticase relaciona con la presencia de floraciones, aunque otroscambios en la estructura comunitaria y/o los efectos combinados de la eutrofización y la contaminación,son poco conocidos. Un enfoque interesante para el estudio microbiológico de muestras ambientaleses el uso de la secuenciación masiva, una herramienta altamente sensible, rápida y cuantitativa. Utilizando esta aproximación sobre el gen codificante para el ARNr 16S, en este trabajo caracterizamos la diversidad bacteriana en muestras de agua tomadas en un gradiente espaciala lo largo del río Uruguay y del Río de la Plata. Al mismo tiempo analizamos los resultados en base al origen de las muestras (agua dulce, frente estuarino o marino) y a la presencia de cianobacterias tóxicas, en relación a variables ambientales bióticas y abióticas. Finalmente, determinamos las variables claves relacionadas a la presencia de cianobacterias y otros patógenos en el agua. Los resultados muestran que existen diferencias relevantes en la composición de la comunidad bacteriana dulceacuícola y marina. Observándose una disminución en la riqueza de especies de bacterias heterótrofas en presencia de una floración de Microcystis aeruginosa.

Contacto: eliananervif@gmail.com
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Resumen:
La co-inoculación de leguminosas es una alternativa sencilla y eficaz para mejorar el rendimiento de cosecha, comparado con la inoculación simple. Un ejemplo es la co-inoculación de alfalfa con Sinorhizobium meliloti y Delftia sp. JD2, que aumenta el exudado de flavonoides y aporta auxinas, incrementando la nodulación, crecimiento radicular y el rendimiento vegetal. Este trabajo propone analizar la respuesta del cultivo de soja (Glycine max.) frente a la co-inoculación Bradyrhizobium–JD2. Las semillas se inocularon y co-inocularon con Bradyrhizobium elkanii (1301 y 1302) y/o  Delftia sp. JD2, y se incubaron durante 30 días bajo condiciones controladas. Se determinó la tasa de nodulación (número de nódulos por planta) y el crecimiento vegetal. Finalmente, las plantas se cosecharon y se determinó el largo de parte aérea (LPA) y su peso seco aéreo (PSA). La co-inoculación de las semillas incrementó el LPA (16 %) y el PSA (25 %), en relación a la inoculación simple. La tasa de nodulación mejoró significativamente en plantas co-inoculadas, siendo mayor la cantidad de nódulos por plantas, tanto en raíz principal como en raíces secundarias. Estos resultados sugieren un efecto positivo de la co-inoculación sobre el establecimiento temprano del cultivo de soja. Por otro lado, se utilizaron métodos cromatográficos para determinar diferencias en el contenido de compuestos de bajo peso molecular (CBPM) en  plantas crecidas en condiciones de invernáculo. Para ello, se  cosecharon nódulos, raíces y biomasa aérea en los estadíos de cuarto nudo y floración completa. Resultados preliminares indican que no existen grandes diferencias en los perfiles obtenidos por GC-MS de CBPM, entre los tratamientos. Sin embargo, pequeños cambios en la secreción de algunos metabolitos pueden explicar la promoción del crecimiento observado y la mejor nodulación de soja.

Contacto: braulioriviezzi94@gmail.com
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Resumen:
En el área Bacteriología de la GGL de OSE se procesan muestras de agua de red,  de plantas de depuración y de cursos de agua de todo el país. Como parte del aseguramiento de la calidad se controla el ambiente de trabajo por sedimentación en placas con una periodicidad quincenal. Para ello, en cada Control Ambiental se exponen 11 placas conteniendo TSA distribuidas en toda el área, durante 4 horas y se incuban a (36 ± 2) °C por 72 horas. Con el objetivo de conocer la población bacteriana recuperada en el control ambiental se realizó la descripción morfológica de las colonias, tinción Gram, prueba oxidasa y la identificación por secuenciación del gen ARNr 16S en el transcurso de un año. Cepas recuperadas en los controles fueron sembradas en los medios de cultivo de rutina para corroborar que no interfieran en los ensayos de análisis. De 23 Controles Ambientales realizados en un año se analizaron las placas correspondientes a 17, totalizando 187 placas. Se detectaron 22 morfologías de colonia diferentes, de las cuales  4 estaban presentes en al menos una placa en cada Control Ambiental. Se identificaron 17 aislamientos por análisis de secuencia del gen ARNr 16S, obteniéndose 9 géneros diferentes. Micrococcus, Rathia, Microbacterium y Staphylococcus fueron los recuperados siempre en al menos una placa de cada control estudiado. De los resultados obtenidos es posible concluir que ninguno de los 9 géneros identificados interfiere en los ensayos de rutina realizados en el área, datos que concuerdan con la bibliografía. Como perspectiva se propone extender el análisis de Control Ambiental a todas las Áreas del Laboratorio de la GGL, así como también la caracterización de la comunidad fúngica.

Contacto: gvduartem@gmail.com
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Resumen:
La distribución de agua potable segura y los servicios de saneamiento son pilares fundamentales para la sociedad. Existe especial preocupación en cuanto a la calidad del agua, su escasez, el cambio climático, las inundaciones, las sequías, la utilización de la energía y el daño que le pueda provocar todo ello a la salud humana. De esta forma aparecen nuevos e importantes desafíos para la industria del agua. El presente trabajo expone resultados de análisis microbiológicos y fisicoquímicos realizados en 251 muestras de agua tomadas en diferentes lugares de Uruguay durante la primavera del año 2015. Sólo el 9.6% de las muestras no cumplieron con los requisitos microbiológicos. Los incumplimientos debidos a la presencia de coliformes totales, determinados con un kit comercial incrementan dicho resultado hasta un 14%. La confirmación de los resultados positivos obtenidos con dicho kit fue realizada en CLT (caldo lauril triptosa) incubado durante 48hs para observar la producción de gas. Aquellas muestras que no produjeron gas fueron subcultivadas en diferentes medios sólidos a partir de los cuales se obtuvieron 20 aislamientos. Posteriormente, éstos fueron caracterizados mediante pruebas fenotípicas e identificados según la secuencia del gen codificante del ARNr 16S. Los resultados microbiológicos y fisicoquímicos fueron analizados mediante Analisis Multifactorial (AMF), teniendo en cuenta un grupo de variables cualitativas (parámetros microbiológicos) y otro de variables cuantitativas (parámetros fisicoquímicos). Las primeras cinco dimensiones del AMF explican el 83.2% de la varianza de los datos experimentales. Un análisis de cluster de tipo jerárquico fue realizado para identificar grupos de muestras con características similares. Seis grupos de muestras fueron identificados con diferencias en sus características fisicoquímicas y microbiológicas. Tres de los grupos no cumple con los parámetros microbiológicos (9.6% de las muestras), mientras los demás sí los cumplen pero presentan diferencias en cuanto a las características fisicoquímicas.

Contacto: soledadmartinez027@gmail.com
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Resumen:
La irradiación UV proveniente del sol da lugar a la formación de dímeros de ciclobutano de pirimidinas (CPD) y 6,4-fotoproductos a nivel del ADN. La reparación de estas lesiones es de esencial importancia debido a su potencial altamente mutagénico. Existen diversas estrategias para la remoción de los mismos, pero para algunos organismos son particularmente importantes los mecanismos de reparación mediados por las fotoliasas. Estas enzimas son capaces de revertir estas lesiones. Sin bien la formación y la reparación de las lesiones tipo CPD están bien estudiadas, poco se conoce acerca de las lesiones tipo 6,4-fotoproductos y de las 6,4-fotoliasas. Evidencia reciente sugiere que los 6,4-fotoproductos también juegan un rol importante en la generación de cáncer de piel en humanos, más que los CPDs. Las 6,4-fotoliasas, enzimas que se creían que estaban restringidas a los eucariotas, usan luz azul para llevar a cabo la reparación, fenómeno conocido como fotorreparación. Actualmente estas enzimas se han empezado a reportar en bacterias. En este trabajo, mediante secuenciación completa de un genoma, identificamos una 6,4-fotoliasa proveniente de una bacteria antártica del género Sphingomonas. La secuencia codificante de esta enzima se sintetizó y optimizó para su posterior producción recombinante en Escherichia coli. Se puso a punto la producción de la enzima con alto rendimiento, obteniéndose mayoritariamente en la fracción soluble, y se purificó por cromatografía de afinidad a metales (IMAC). La utilización de 6,4-fotoliasas aún no es un nicho explorado en el mercado dermatológico, pero esta enzima tendría el potencial de reparar las lesiones causadas por la irradiación UV, que derivan en la formación de cáncer de piel. Como perspectiva se espera emplearlas en conjunto con CPD-fotoliasas, para así ampliar el espectro de acción de las cremas fotorreparadoras.

Contacto: j_jmarrena@hotmail.com
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Resumen:
Los carotenoides son isoprenoides sintetizados por todos los organismos  fotosintéticos y algunos no fotosintéticos como bacterias y hongos. Los seres humanos, incapaces de sintetizar carotenoides de novo, deben incorporarlos mediante la dieta ya que son importantes  antioxidantes. Las bacterias antárticas de naturaleza psicrotolerante, han desarrollado estrategias como la producción de pigmentos para sobrevivir en condiciones extremas. El aislamiento y la alta presión selectiva a la que esos microorganismos han sido sometidos motiva el estudio de las bacterias antárticas como productoras de pigmentos naturales. Este trabajo tiene como objetivo aislar, caracterizar  e identificar bacterias antárticas productoras de pigmentos. Se aislaron 20 cepas de muestras recolectadas en Isla Rey Jorge, seleccionándose para su identificación aquellos en los que se detectó producción de pigmentos coloreados amarillos y anaranjados. La identificación de las cepas se realizó por TP-RAPD fingerprinting y secuenciación del ADNr 16S. El análisis filogenético evidenció la presencia de cinco géneros, mostrando un predominio del género Arthrobacter. Para caracterizar las cepas se evaluó su crecimiento en placas de TSA a cuatro temperaturas. Éstas crecieron a 4, 10 y 24°C, no observándose crecimiento a 37°C. Con el fin de caracterizar los pigmentos producidos, se analizaron las muestras extraídas mediante espectrofotometría (UV-visible) y HPLC. De acuerdo a la longitud de onda de los máximos de absorción y la estructura fina de los espectros de todos los extractos analizados, se presume la presencia de carotenoides. Del análisis en HPLC, se pudieron identificar tentativamente por coelución con estándares, la presencia de zeaxantina y luteína en los extractos de las cepas de Flavobacterium antarcticum y Chryseobacterium marinum.Considerando que dichos carotenoides tienen interés comercial, se continuará el estudio con fermentación en matraces para optimizar de las condiciones operativas y el diseño del medio de cultivo.

Contacto: frissom@gmail.com
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Resumen:
Las floraciones de cianobacterias son una seria amenaza para la salud humana y para los ecosistemas acuáticos debido a su producción de cianotoxinas, siendo las especies del complejo Microcystis aeruginosa (CMA) las generadoras de floraciones más frecuentes a nivel mundial. Las especies del CMA son coloniales, productoras de microcistinas y algunos estudios sugieren que existen diferencias en la producción de cianotoxinas relativas al tamaño de la colonia, sugiriendo que podría usarse como un bio-marcador de la calidad del agua. Se ha propuesto que las colonias más tóxicas serían aquellas mayores a 100µm, aunque la relación tamaño-toxicidad no sería lineal y la toxicidad disminuiría en colonias mayores a 270µm. El objetivo de este trabajo fue estudiar la relación entre diferentes fracciones de tamaño de colonias del CMA y su toxicidad.  Para ello, las muestras de agua se tamizaron en cuatro fracciones de tamaños y se cuantificó la abundancia y expresión del gen mcyE (involucrado en la síntesis de microcistinas) mediante qPCR a cada fracción. Se observó que la mayor abundancia del gen mcyE correspondía a la fracción de tamaño intermedio (entre 150 y 50µm) y mediante la generación de modelos estadísticos observamos que el biovolumen de esta fracción fue la principal variable que explicó la abundancia del gen mcyE. Ligado a esto se obtuvo que la mayor expresión del gen se dio en las fracciones intermedias y mayores. Finalmente, el análisis de diversidad de genotipos tóxicos (mediante High Resolution Melting Analysis) demostró la presencia de dos genotipos, uno que agruparía a las mayores de 50µm y otro a las menores, explicando de este modo las diferencias en la abundancia y expresión del gen. Este trabajo confirmó que existe una relación entre el tamaño y la toxicidad de las colonias del CMA, aunque esta relación no sería lineal.

Contacto: susanadeus.deusalvarez@gmail.com
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Resumen:
El consumo de probióticos es una estrategia ampliamente utilizada con el fin de mejorar la salud de humanos y animales. En el caso de las abejas melíferas, es una alternativa interesante, ya que a pesar que éstas son afectadas por múltiples patógenos, no es recomendable el uso de antibióticos para su control. En estudios previos de nuestro grupo de investigación se obtuvo un probiótico compuesto por cuatro cepas de Lactobacillus kunkeei, aisladas de la microbiota intestinal de abejas. Su administración en modelos de cría de abejas y larvas en condiciones controladas de laboratorio resultó segura; y logró disminuir la infección por el hongo Nosema ceranae en abejas y la bacteria Paenibacillus larvae en larvas. El objetivo del presente trabajo fue optimizar el protocolo de aplicación del probiótico para su futura aplicación en colmenas. En primer lugar se puso a punto una metodología basada en PCR en tiempo real para la cuantificación de L. kunkeei en abejas. Posteriormente se administró el probiótico por vía oral (en jarabe) en un modelo de cría de abejas en laboratorio, en diferentes dosis y frecuencias, y se evaluó la persistencia de estas cepas en el intestino de las abejas. La metodología de PCR cuantitativo nos permitió detectar y cuantificar el número de células de L. kunkeei en el intestino. Se encontró que luego de las 72 hs luego de la administración del probiótico comienza a aumentar el número de células de L. kunkeei en el intestino. El máximo se alcanza entre el quinto y séptimo día luego de la administración. Resultados similares se obtuvieron al analizar diferentes dosis. Estos resultados fueron tenidos en cuenta en el diseño del ensayo de campo que se está realizando actualmente, con el fin de evaluar el impacto del probiótico en la salud de colmenas.

Contacto: danielarpapiol@gmail.com
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Resumen:
Las floraciones de cianobacterias afectan a los animales y los ecosistemas acuáticos, afectando la disponibilidad de oxígeno, el ciclado de nutrientes, la estructura de las comunidades y la composición de la cadena trófica. Además, algunas especies tienen la capacidad de producir cianotoxinas, constituyendo una amenaza para el consumo de agua. Según su modo de acción las toxinas pueden ser clasificadas en: hepatotoxinas (microcistinas, MCY), neurotoxinas (saxitoxinas, SXT) y otras. El objetivo de este trabajo es dilucidar la potencial toxicidad de muestras del embalse de Salto Grande obtenidas durante seis meses (verano e invierno), las que presentaron especies de cianobacterias potencialmente productoras de microcistinas y saxitoxinas (Microcystis y Dolichospermum, respectivamente). Se evaluó si la presencia y abundancia de dichas especies se correlacionó con la presencia y abundancia de genes involucrados en la síntesis de MCY (gen mcyE) y SXT (gen sxtU). Para ello, se puso a punto un método para extraer ADN de muestras fijadas con lugol durante más de un año y se cuantificó el número de copias de mcyE y sxtU mediante qPCR en tiempo real. La presencia de mcyE se detectó en todos los sitios durante ambas estaciones del año, correlacionándose positiva y significativamente con la abundancia de células de Microcystis, la cual a su vez se asoció positivamente con la temperatura. Por otro lado, sxtU solo fue detectado en un sitio en ambas estaciones del año, asociado positivamente a la temperatura y a la concentración de fosfato. Cuando se usó la concentración de ADN como indicador de la biomasa total, también se encontró una correlación positiva con la temperatura. Nuestros resultados sugieren que a mayores temperaturas se genera una mayor biomasa de cianobacterias, especialmente de especies tóxicas del género Microcystis. En el caso de especies d e Dolichospermum, su abundancia estaría principalmente influída por los nutrientes.

Contacto: facu.lepillanca@gmail.com
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Resumen:
Las especies de cianobacterias del complejo Microcystis aeruginosa (CMA) generan floraciones tóxicas típicas en ecosistemas límnicos, reportándose que el aumento de salinidad afecta negativamente su crecimiento. Diversos trabajos han demostrado que algunas especies del CMA responden diferencialmente a los aumentos de salinidad, ocurriendo lisis celular a salinidades similares a las estuarinas. Nuestro objetivo fue evaluar el efecto de la salinidad sobre especies del CMA típicas de ecosistemas límnicos. Para ello, una muestra de agua del embalse de Salto Grande dominada por organismos del CMA y se incubó 10 días en salinidades de 5, 10 y 25. Se analizó la abundancia y expresión del gen mcyE, involucrado en la síntesis de microcistinas, mediante qPCR. La biomasa del complejo MCA se mantuvo constante en las tres condiciones de salinidad pero la abundancia de genotipos tóxicos aumentó luego de diez días de incubación a salinidades de 5 y 10, pero no a 25. La expresión del gen mcyE aumentó significativamente luego de cuatro horas de incubación a salinidades de 5 y 10 y se inhibió completamente en la salinidad de 25. Estos resultados muestran que las especies del CMA pueden tolerar salinidades similares a las estuarinas y que su toxicidad está relacionada con la magnitud del estrés salino. El análisis de diversidad de genotipos tóxicos mediante High Resolution Melting Analysis demostró que diferentes salinidades seleccionan distintas poblaciones del CMA. Se propone que cuando las especies del CMA son transportadas de un ecosistema de agua dulce a agua salobre enfrentan un estrés salino (salinidades entre 5 y 10) que estimula la síntesis de toxinas y selecciona genotipos específicos y luego inhibirse cuando se enfrenta a salinidades mayores (25).  

Contacto: gmesiri@gmail.com
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Resumen:
La dehidrozingerona, 4-(4-hidroxi-3-metoxifenil)-3-buten-2-ona, se obtiene a partir de la raíz del gengibre (Zingiber officinale) y posee diversas actividades biológicas (antimicrobianas, antiinflamatorias, antioxidantes y anticancerígenas). Se ha reportado que la actividad antimicrobiana de análogos de la dehidrozingerona depende de la presencia del grupo 4-OH libre. En este trabajo se describe la síntesis de una serie de análogos de dehidrozingerona, de estructura general H₃C-CO-CH=CH-Ar, donde el grupo aromático se encuentra sustituído con grupos fenólicos en diferentes posiciones. Todos los compuestos fueron obtenidos con buenos rendimientos y caracterizados por RMN y EM. En una etapa posterior se determinarán sus propiedades antimicrobianas y antioxidantes.

Contacto: gjsagrera@gmail.com
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Resumen:
Las isoflavonas son un grupo de flavonoides que poseen diversas actividades biológicas como antioxidantes, antimicrobianas, anticancerígenas, estrogénicas y otras. Muchas isoflavonas son compuestos naturales que existen en plantas. La genisteína se encuentra presente en la soja y posee importantes propiedades antioxidantes, pero su hidrofobicidad dificulta la administración oral. La incorporación de la genisteína en liposomas es una alternativa viable para su uso y así es importante desarrollar un sistema farmacológico eficaz y de baja toxicidad. Con el fin de controlar la permeabilidad de la genisteína en la membrana liposomal, es importante testear asociaciones de lípidos con distintos estados de fases. En este contexto, es importante el uso de colesterol, porque tiene la capacidad de condensar monocapas fosfolipídicas y reducir la permeabilidad de los liposomas y también conocer la influencia de la genisteína en la dinámica molecular de un sistema que consiste en dimiristoilfosfatidilcolina y colesterol. Previamente, la investigadora principal ha estudiado las interacciones moleculares entre genisteína y liposomas compuestos por DMPC y colesterol por medio de RMN de fósforo y protón y calorimetria diferencial de barrido, encontrando que la genisteína causa un mayor grado de orden tanto en la región polar, como en la región apolar de los liposomas. El orden en la membrana causado por la genisteína puede influir en su actividad antioxidante, reduciendo la movilidad de los radicales en la membrana y las reacciones de radicales libres. Con el objeto de continuar con estas investigaciones hemos decidido preparar una serie de análogos de la genisteína. En este trabajo se prepararon cinco isoflavonoides, en dos etapas: reacción entre un fenol y un ácido fenilacético para formar una desoxibenzoína, la cual luego cicla para dar la correspondiente isoflavona. Todos los compuestos se han caracterizado por RMN y EM y sus rendimientos se encuentran en etapa de optimización.

Contacto: titakimica@gmail.com
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Resumen:
Las chalconas son flavonoides que poseen la estructura básica de 1,3-difenil-2 propenona. Entre sus actividades biológicas, la propiedad antioxidante se destaca por su importancia en la terapia anti-cáncer. La actividad antioxidante de chalconas está asociada con la reducción de radicales libres y la quelación de los metales. Un efecto protector en membranas biológicas puede ser un mecanismo secundario, así que es importante conocer los efectos de las chalconas en propiedades de bicapas lipídicas. En este estudio se realizó la síntesis de dos chalconas (4-hidroxichalcona y 2’,4-dihidroxichalcona) y se evaluó la actividad antioxidante y su efecto en la turbiedad de liposomas.  La síntesis de las chalconas se realizó en tres etapas: protección de los grupos fenólicos de los precursores como éteres de tetrahidropiranilo, condensacion aldólica y remoción de los grupos protectores. El potencial de reducción de las chalconas fue evaluado por el método de 2,2-difenil-1-picril-hidrazilo (DPPH) y sus efectos contra la peroxidación de liposomas detectados por el método TBARS. Los liposomas fueron preparados por el método de hidratación de película lipídica. Los ensayos de turbiedad de liposomas fueron hechos por espectrofotometría UV-vis. Los resultados muestran una relación entre la presencia de grupos hidroxilos con la actividad antioxidante y la dinámica molecular de membranas, contribuyendo para el desarrollo de candidatos de medicamentos más eficaces para el tratamiento de diversas enfermedades

Contacto: nichole_osti@hotmail.com
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Resumen:
El Cannabis es una planta con múltiples aplicaciones, tanto industriales como medicinales. Sus usos como droga de ritual y con fines terapéuticos datan de hace más de 4.000 años en el continente asiático. Se conocen 109 fitocannabinoides además de terpenos, flavonoides, esteroides entre otros grupos de metabolitos presentes en el cannabis. Actualmente sus usos medicinales han despertado gran interés debido a los continuos descubrimientos de las implicancias que el sistema endocannabinoide presenta en varios procesos fisiológicos. En el sistema cardiovascular existen evidencias sobre la utilidad terapéutica de los cannabinoides en la aterosclerosis y en la protección ante el daño generado por isquemia-reperfusión. En este trabajo se estudió el perfil de cannabinodes presentes en extractos de inflorescencias femeninas de dos fenotipos de Cannabis sativa mediante ¹H-RMN en distintas etapas de maduración y su capacidad para inhibir la lipoperoxidación de la lipoproteína de baja densidad (LDL), proceso fuertemente ligado al desarrollo de la aterosclerosis. Se evidenció una acumulación de metabolitos, entre ellos cannabinodes, en los tricomas glandulares durante la etapa final del desarrollo de la floración. El principal cannabinoide encontrado en los extractos analizados fue el ácido carboxílico Δ9-THC (THC-A) (~30%) y en una proporción mucho menor su producto de descarboxilación, con propiedades psicoactivas, el Δ9-THC (~1%). No se registró la presencia de otros cannabinodes en los extractos analizados debido a la sensibilidad de la técnica utilizada. Por otra parte los extractos presentaron la  capacidad de interrumpir las cadenas de propagación de la lipoperoxidación  en LDL mediada por Cu²⁺, con CI₅₀ en el rango de 1,7-4,6 μg/mL dependiendo de la variedad y el grado de maduración de las flores.

Contacto: brunomusetti@hotmail.com
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Resumen:
Since post-transcriptional regulation is the main level of gene expression control in trypanosomatides, the determination of actively translated mRNA seems particularly adequate to analyze gene expression profiles. We previously applied translatomic analysis and detected significant differences in the expression and translational efficiencies of several gene groups. In particular, the genes for ribosomal proteins and trans-sialidases were significantly regulated at these levels. To deepen our understanding of the mechanisms and signals that determine these regulatory processes we created UTRme (UTR-mini-exon), a program to annotate UTRs in Trypanosoma cruzi. Using pair-end RNA-Seq data and an annotated genome, UTRme annotates the UTRs and assigns them a reliability index, which indicates the confidence with which the polyadenylation and transplicing sites were detected. The program is based on several read filtering steps (through trimming and alignment) in order to obtain a reliable set from which the annotation will be generated. The score assigned to each site depends on the number of reads that support it, the differences between the bases of polyadenylated or transpliced read with its aligned genomic region, the number and percentage of adenines for 3’UTRs, among others. UTRme allowed us to determine the use of preferential sites according to the parasitic stage and search for signals in UTRs, both at the level of primary sequence and secondary structure, that might explain the observed co-regulation of family members. Finally, we expect that UTRme will enable researchers to obtain reliable UTRs regions to be used in their own projects.

Contacto: sradio91@gmail.com
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Resumen:
Desde hace un tiempo se sabe que los tripanosomátidos son capaces de sintetizar prostaglandinas. Este descubrimiento plantea interrogantes sobre cuál es el rol de estos lípidos bioactivos durante las infecciones parasitarias. El presente trabajo se enmarca en el estudio de la relevancia de la síntesis de prostaglandina F₂α (PGF₂α) para Trypanosoma cruzi en el establecimiento de la infección. La mayor parte de las PGF₂α sintasas caracterizadas pertenecen a la familia proteica Aldo-Keto reductasa (AKR). Sin embargo, en T. cruzi la síntesis de PGF₂α es catalizada por TcOYE que pertenece a la familia proteica Old Yellow Enzyme (OYE). Esta proteína no presenta homólogos en mamíferos ni otros tripanosomátidos. Por otro lado, existe una proteína perteneciente a la familia AKR (TcAKR) cuya actividad PGF₂α sintasa no pudo ser determinada in vitro y su función biológica es desconocida. En este contexto, se realizaron estudios estructurales, evolutivos y funcionales de TcAKR y TcOYE para dilucidar las principales diferencias entre ellas y su relevancia en la infección. Se estudió la localización subcelular, expresión en ciclo de vida y expresión en diferentes cepas de ambas proteínas. Se realizó la sobreexpresión y se evaluó el efecto en la infectividad mediante ensayos in vitro y en modelo murino. Paralelamente, se realizó una búsqueda de todos los genes pertenecientes a las familias proteicas OYE y AKR en los genomas de protozoo disponibles con el fin de determinar la distribución en las diferentes especies y sus relaciones filogenéticas para dilucidar cuál fue el evento evolutivo que determinó la particularidad de que TcOYE catalice la síntesis de PGF₂α en T. cruzi. Este abordaje implicó el desarrollo de un conjunto de scripts cuyo uso en forma secuencial permite la identificación de todos los homólogos de un gen en un conjunto de genomas de interés, independientemente de la anotación del genoma.

Contacto: florenciad@pasteur.edu.uy
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Resumen:
Avances en el entendimiento de las bases moleculares del ciclo proliferativo de Trypanosoma cruzi pueden acelerar el desarrollo de estrategias quimioterápicas contra la enfermedad de Chagas, la cual continúa siendo una grave problemática en regiones endémicas de Latinoamérica. Para estudiar los patrones de expresión génica durante el ciclo celular del parásito, se realizaron análisis transcriptómicos (RNA-seq de ARNm poliadenilados) y traductómicos (RNA-seq de huellas ribosomales) sobre epimastigotas sincronizados mediante Hidroxiurea. Se obtuvieron poblaciones de parásitos  en G1, S y G2/M, (70% de enriquecimiento analizado mediante citometría para contenido de ADN). Por secuenciado profudo de los ARNm (30 millones de lecturas mapeadas/muestra) se identificó un grupo de 305 genes diferencialmente regulados en el ciclo (CR-DEGs, cambio ≥1.5, p-valor <0.01). Aquí se afectan funciones relacionadas al metabolismo energético de carbohidratos (G1), replicación del ADN en (S) y movimiento asociado a microtúbulos (G2/M). Para el traductoma nos focalizamos en la transición G1-S, donde se obtuvieron 12 millones de lecturas mapeadas en ARNm, para 7860 genes con al menos 10 lecturas. Curiosamente, a nivel traduccional se afectaron 1784 genes (CT-DEGs, cambio ≥2, FDR <0.05), 923 y 861 de estos resultaron regulados al alta en G1 y S respectivamente, mostrando enriquecidas funciones relacionadas a la síntesis del ribosoma, metabolismo de nucleótidos y dinámica de microtúbulos. Los genes regulados en el ciclo muestran propiedades estructurales y funcionales distintivas, como distancia al inicio transcripcional, contenido GC, uso de codones, largo génico y de regiones no-traducidas (UTRs). También se presentan resultados de búsquedas de motivos estructurales y de secuencia. Finalmente, nuestros datos sugieren una regulación coordinada de los ARNm periódicamente expresados, basada en propiedades conservadas de los transcriptos y la cual depende predominantemente en la traducibilidad más que en la estabilidad de estos.

Contacto: schavez@fcien.edu.uy
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Resumen:
Las peroxirredoxinas (Prx) son una familia de enzimas presentes en archaeas, bacterias y eucariotas, que se caracterizan por su capacidad de reducir peróxido de hidrógeno (H₂O₂), alquil hidroperóxidos y peroxinitrito a través de un mecanismo basado en cisteínas. Además de su rol detoxificante, tienen un rol principal en la señalización celular mediada por H₂O₂. En su sitio activo se destacan una cisteína peroxidática (C_P) y una cisteína resolutiva (C_R). La C_P es la que reduce el H₂O₂ a H₂O, mientras que la C_R participa en el reciclado de la enzima, que comienza por la formación de un disulfuro entre ambas cisteínas. Una particularidad de las Prx como enzimas antioxidantes, es que pueden ser sobreoxidadas en su C_P si una segunda molécula de H₂O₂ reacciona con la misma antes de formar el disulfuro con la C_R, inactivándose. Poseen además estructura cuaternaria definida, manteniendo equilibrio entre dímeros y decámeros activos. Entre las 6 isoformas presentes en humanos, se encuentran Prx1 y Prx2, las cuales además de tener la misma localización celular (citosol)  poseen un 78% de identidad aminoacídica y un 90% de homología. A pesar de estas similitudes, se presume que poseen funciones distintas y únicas. Buscando esclarecer los mecanismos que expliquen estas diferencias, se purificaron las proteínas recombinantes Prx1 y Prx2 humanas y se estudió su oxidación por H₂O₂ siguiendo los cambios de fluorescencia intrínseca de las proteínas durante esta reacción. Según los parámetros determinados, si bien las constantes de reacción con H₂O₂ son similares, las constantes de velocidad de cierre del disulfuro presentan diferencias importantes, lo cual se asocia a diferencias en su sensibilidad a sobreoxidarse. También se exploró el efecto de su estado redox en su oligomerización, así como diferencias en el consumo catalítico del sustrato.  

Contacto: joaquindallari@gmail.com
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Resumen:
En trabajos previos encontramos que la despolarización del potencial de membrana plasmática (DPMP) de células de endotelio de córnea de bovino en cultivo (BCEC) provoca la remodelación del citoesqueleto de actina y tubulina. Asimismo, hallamos que la DPMP activa a la vía del cAMP/PKA y que ésta parece participar en la reorganización de la actina-F cortical. El objetivo de este trabajo fue determinar, por un lado, si la vía del cAMP/PKA está implicada en la remodelación de los microtúbulos en respuesta a la DPMP en BCEC y, por otro si existe un acoplamiento entre los microtúbulos y los microfilamentos durante dicha respuesta.   Mediante estudios de microscopía confocal pudimos identificar distintas poblaciones de microtúbulos en BCEC. La DPMP provoca la disminución de la población de microtúbulos corticales que se extiende longitudinalmente a lo largo del eje ápico-basal. Los inhibidores de la adenilil ciclasa soluble y de la PKA bloquean este cambio. Los microtúbulos parecen ser más sensibles a la DPMP que los microfilamentos. El paclitaxel, una droga que estabiliza los microtúbulos, no parece afectar los efectos de la DPMP sobre los microfilamentos. La desestabilización de los microtúbulos con nocodazol conduce por sí misma a un incremento de las fibras de estrés basales y, reduce la remodelación de la actina-F cortical provocada por la DPMP. Una desestabilización controlada de los microfilamentos con citocalasina, atenúa el efecto de la DPMP sobre los microtúbulos. En su conjunto, estos resultados sugieren que la vía de la cAMP/PKA podría estar implicada en la reorganización de los microtúbulos en respuesta a la DPMP. Asimismo, no resulta evidente el acoplamiento en los cambios de los filamentos de tubulina y actina frente a la DPMP.

Contacto: francesevans82@yahoo.com
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Resumen:
Caiman latirostris is a reptile with temperature sex determination (TSD). In ovo exposure to xenoestrogens overcomes the effects of temperature (hormonal sex determination; HSD). External genitalia (phallus) from TSD- males and females are similar in gross anatomy; however, male phallus continues increasing its size as caiman grows. The aims were to evaluate histo-architecture and hormone receptor status in the phallus of juvenile caimans to describe the sexual dimorphic pattern and to determine whether the phallus of HSD-female caimans differs from the phallus of TSD-females. Archived paraffin embedded samples from juvenile caimans were used. Groups were as follow: TSD-male, TSD-female and HSD-female (incubated at male producing TºC and exposed in ovo to 1.4 ppm of 17β-Estradiol). From the base to the glans, external genitalia of male and female are composed by a collagen rich corpus cavernosum (CC), surrounding a vascularized smooth muscle tissue, where a ventral invagination of the external epithelium (sulcus) is anchored to. PAS+ staining cells were present in the deep sulcus and in the external epithelia; muscle cells exhibited cytoplasmic PAS+ granules. Sexual dimorphism was exhibited by: 1) collagen fiber organization in the CC that is densely packed in males versus loosely packed in females, 2) the spatial orientation of muscle fibers 3) peripheral innervations is higher in females than in males, and 4) AR and ER expression are both higher in males than in females. Results demonstrate that, sexual dimorphism of caiman phallus is not only restricted to its growing dynamics, but also to histological features and hormone dependency. Aditionally, HSD-female phallus differs from TSD-females. Significant, AR and ERα expression in TSD-female phallus resembles that observed in TSD-males. Masculine features of external genitalia from HSD-females could alter their reproductive behavior and/or performance.

Contacto: yamiltavalieri@outlook.com
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Resumen:
Los estados de dormancia permitieron a los seres vivos conquistar las regiones más extremas del planeta, mediante adaptaciones a ambientes hostiles. Las detenciones del desarrollo embrionario o diapausas en los peces anuales, son ejemplos de dormancia, estrategia de supervivencia adaptada a la desecación de las efímeras masas de agua en las que viven. En estas detenciones las actividades vitales disminuyen dramáticamente hasta que se vuelve a llenar el charco, donde la detención y el reinicio del desarrollo están determinados por señales ambientales, factores genéticos y epigenéticos. A pesar del papel crucial de las diapausas en los embriones de peces anuales, los mecanismos moleculares implicados principalmente en la diapausa I, son desconocidos. En este contexto, enmarcado dentro de mi proyecto de doctorado, junto a nuestro grupo de investigación “Análisis de los mecanismos subyacentes a las diapausas en peces anuales” dirigido por la doctora Arezo, proponemos contribuir a la caracterización de la diapausa I (DI) en especies del género Austrolebias a nivel morfológico y molecular, mediante diferentes abordajes. En este trabajo se presentarán datos sobre el sistema de inducción empleado, así como la distribución y morfología celular en embriones detenidos en DI identificando los dos fenotipos alternativos observados por nuestro grupo en el laboratorio. A nivel molecular, los resultados de cuantificación de ARN en diapausa I, así como en estadios previos y posteriores de la misma, serán tomados como parámetro para evidenciar regulación de la expresión génica. Estos abordajes son los primeros pasos hacia la caracterización de la diapausa I en estos vertebrados extremófilos, definidos por la tolerancia de sus embriones a factores de estrés ambiental. En este sentido, responder a las interrogantes sobre la regulación de sus diapausas es un desafío que proyecta el conocimiento básico a aspectos biomédicos.

Contacto: npapa@fcien.edu.uy
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Resumen:
La enfermedad de Chagas, es una enfermedad potencialmente mortal causada por el parásito protozoario Trypanosoma cruzi. En la actualidad, los fármacos utilizados muestran una eficacia variable con efectos secundarios indeseables. La eficacia en la infección por parte del parásito está asociada a su capacidad de resistir el ataque oxidativo del hospedero y de evadir la respuesta inmunitaria. Las triparredoxinas peroxidasas contribuyen a la capacidad antioxidante del parásito y constituyen factores de virulencia para la enfermedad de Chagas. En este trabajo evaluamos la respuesta inmunológica de la triparredoxina peroxidasa citosólica de T. cruzi (cTXNPx). Para ello utilizamos cTXNPx y una versión mutada en la cisteína peroxidática 52 (cTXNPxC52S), que carece de actividad peroxidasa. El análisis de la respuesta inmune celular y humoral se realizó en animales inoculados con cTXNPx, y cTXNPxC52S, a través del análisis del título de anticuerpos específicos en suero y de la proliferación de linfocitos T. Los resultados obtenidos indican que los esplenocitos de los animales inoculados con cTXNPx tienen un mayor índice de proliferación de linfocitos TCD4+ y TCD8+, asociado a una mayor producción de IFNγ, indicando que la cTXNPx favorece la proliferación específica y policlonal en linfocitos TCD4+ y TCD8+. Sin embargo, encontramos mayor título de anticuerpos específicos, tanto IgG como IgM en los animales inoculados con cTXNPxC52S, sugiriendo una activación de las células B diferente inducida por ambas proteínas. Nuestros resultados indican que la proteína sin actividad peroxidasa genera respuestas inmunológicas humorales y celulares diferentes a la nativa, lo cual podría deberse a una presentación antigénica diferencial. Los resultados de este trabajo contribuyen a la comprensión de la respuesta inmunológica inducida por factores de virulencia de T. cruzi.

Contacto: llopez@pasteur.edu.uy
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Resumen:
Las plaquetas son células sanguíneas anucleadas pequeñas (2 a 3 µm) que se originan del citoplasma de los megacariocitos en la médula ósea, siendo su concentración sanguínea entre 150 y 400 mil por μL y su vida media de 10 días aproximadamente. Además de su rol fundamental en la hemostasia, recientemente se ha planteado que las plaquetas podrían utilizarse como biomarcador de un gran número de patologías sistémicas, tales como enfermedades neurodegenerativas, cardiovasculares, cáncer y diabetes, entre otras que cursan con disfunción mitocondrial. Se ha demostrado que la bioenergética celular de las plaquetas es alterada en presencia de dichas patologías debido a la exposición de las mismas durante la maduración en la médula ósea a condiciones de estrés metabólico e inflamatorio sistémico. En este trabajo se puso a punto un protocolo para la evaluación de la bioenergética de plaquetas humanas mediante la utilización de un analizador de flujo extracelular que permite estudiar cambios de concentración de oxígeno y pH. La puesta a punto se realizó con sangre de 12 voluntarios sanos, previo consentimiento informado. Se determinó el número de células óptimo a utilizar, encontrándose un rango lineal de consumo de oxígeno cuando se usaron entre 10 y 50 x 10⁶ plaquetas por pocillo. Se establecieron las concentraciones óptimas de inhibidores y desacoplantes mitocondriales y la utilidad del uso de prostaglandina I₂ como antiagregante durante el aislamiento de las plaquetas. Posteriormente se analizaron plaquetas de 2 niños, uno con enfermedad OXPHOS comprobada por secuenciación del ADNmit y el otro con un síndrome clínico compatible con enfermedad OXPHOS. Se encontraron diferencias significativas con los controles en la máxima capacidad respiratoria y en la capacidad de reserva. Postulamos que evaluar la función mitocondrial en plaquetas podría sustituir el uso de biopsias musculares o de piel para diagnosticar la disfunción mitocondrial en enfermedades OXPHOS.

Contacto: santiago.mansillam@gmail.com
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Resumen:
La aconitasa mitocondrial (ACO2), es una enzima esencial del ciclo de Krebs que cataliza la isomerización reversible de citrato a isocitrato mediante un intermediario cis-aconitato. Esta enzima, que posee un centro [4Fe-4S] en su sitio activo, ha sido identificada como uno de los principales blancos de especies reactivas del oxígeno y del nitrógeno, siendo preferencialmente modificada e inactivada por oxidantes durante el envejecimiento y en patologías que cursan con disfunción mitocondrial. El objetivo de este trabajo fue la expresión, purificación y caracterización bioquímica de una ACO2 de mamífero expresada como proteína de fusión con glutatión S-transferasa. Se logró purificar una ACO2 recombinante murina, con una pureza del 91%. Se obtuvo información importante sobre el plásmido y el gen codificante ya que no se contaba con información suficiente al comenzar el trabajo; y se determinó el peso molecular de la enzima de 90,1 ± 5,3 kDa. Se determinó la actividad enzimática por ensayo directo, acoplado y gel de actividad, pudiéndose determinar los K_M para los tres sustratos: 624 ± 28 µM para citrato, 838 ± 33 µM para isocitrato y 11,7 ± 1,1 µM para cis-aconitato. Se calcularon las constantes de reacción de segundo orden de la ACO2 murina con peroxinitrito y peróxido de hidrógeno obteniéndose valores de 1,3 x 10⁵ M^-1s^-1 y 6 x 10² M^-1s^-1 respectivamente, en el orden de los reportados previamente para otras especies. La inactivación de la ACO2 murina mostró ser reversible tras la incubación con hierro, azufre y un agente reductor en condiciones anaerobias, evidenciando la reactividad de los oxidantes con el centro ferrosulfurado.

Contacto: santiago.mansillam@gmail.com
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Resumen:
La composición de la membrana plasmática es determinante para la movilidad y viabilidad de espermatozoides maduros. El espermatozoide maduro produce especies reactivas de oxígeno, que incrementan con la edad y producen lipoperoxidación de las membranas, repercutiendo en  movilidad/viabilidad. La terapia de reposición lipídica (TRL) consiste en el reemplazo de lípidos peroxidados por una mezcla de glicerofosfolípidos en proporciones similares a las encontradas en las membranas biológicas resistentes a la lipoperoxidación (NTFL). Previamente hemos reportado que la incubación de espermatozoides humanos con NTFL en el rango 0.01-3%, disminuye el efecto negativo sobre la movilidad (medida de acuerdo a OMS), cuando son sometidos a vías de aumento del stress oxidativo (Costa et al.,2015). En este trabajo evaluamos la TRL lipídica en espermatozoides humanos maduros, observando integridad de membranas y reporte fluorescente de potencial de membrana mitocondrial. Nuestros resultados muestran que NTFL 0.01-0.1% ultrasonicado y centrifugado, origina submicronanomicelas que se pueden observar al microscopio, que incorporan pigmentos fluorescentes y que los espermatozoides incubados con dichas submicronanomicelas con pigmentos, incorporan los marcadores presentes en las mismas, incorporando probablemente NTFL. Las curvas dosis-respuesta de motilidad de espermatozoides vs. H2O2, desplazan sus valores de dosis media de inhibición a valores más positivos, indicando un rol protector de la incubación de NTFL ante la exposición a H2O2. La citometría de flujo de espermatozoides humanos maduros cargados con JC1, indican que la incubación con NTFL aumenta la población de espermatozoides con mayor potencial mitocondrial, respecto a los incubados solo con H2O2. Estudios en microscopía confocal con Rhodamina123 y JC1, consistentemente con los resultados anteriores, indican un rol antioxidante de NTFL. En conclusión, los espermatozoides humanos maduros son un buen modelo para estudiar TRL con NTFL, sugiriendo que la misma es efectiva para prevenir el daño oxidativo a nivel de membranas biológicas.                        

Contacto: ferreira@fmed.edu.uy
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Resumen:
El balance energético negativo se desarrolla durante el periparto, un período donde la vaca lechera se enfrenta a una gran demanda de nutrientes por parte del feto y para la producción de leche. Con el fin de atender a esta demanda, se movilizan reservas corporales y aumenta la lipólisis, la cetogénesis, glucogenólisis y gluconeogénesis. En este trabajo se planteó elaborar un protocolo de criopreservación de biopsias de hígado bovino para estudiar el efecto del balance energético negativo sobre la función mitocondrial. Se compararon diferentes condiciones de congelamiento de biopsias de hígado y se analizó la función mitocondrial por medio de respirometría de alta-resolución en un oxímetro (Oroboros Oxygraph-2K), en presencia de sustratos de los complejos I y II de la cadena respiratoria. A partir de las medidas de velocidad de consumo de oxígeno obtenidas en ausencia/presencia de inhibidores y desacoplantes de la fosforilación oxidativa se determinó la máxima capacidad respiratoria, la respiración en estado 3 y el índice de control respiratorio. En las muestras criopreservadas se agregó citocromo c para evaluar la integridad de membrana y se observó un aumento de la respiración con respecto a las biopsias frescas (p < 0,05). Se agregó citocromo c a todas las medidas posteriores. No encontramos diferencias significativas en la máxima capacidad respiratoria, respiración en estado 3 e índice de control respiratorio para el complejo I entre muestras frescas y criopreservadas. Solo el índice de control respiratorio para el complejo II se vio afectado. El estudio de función mitocondrial durante la lactancia demostró que las biopsias tomadas de vacas en el balance energético negativo y cercanas al pico de lactancia, presentaban una máxima capacidad respiratoria disminuida (p < 0,05) con respecto a las vacas en lactancia tardía. Sugiriendo que la función mitocondrial se encuentra comprometida durante el balance energético negativo.

Contacto: garciaroche.m@gmail.com
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Resumen:
El éxito de Mycobacterium tuberculosis como patógeno humano reside principalmente en su capacidad de sobrevivir en macrófagos y mantener una infección latente. Existen evidencias de que la Ser/Thr-quinasa PknG de M. tuberculosis regula procesos críticos del metabolismo micobacteriano y que tiene además un rol en la capacidad de la bacteria de persistir en los macrófagos inhibiendo la maduración fagosomal. Sin embargo, los mecanismos moleculares subyacentes a esta acción son aún poco comprendidos. Con el fin de elucidar en qué procesos biológicos participa PknG llevamos a cabo una aproximación interactómica usando PknG de M. tuberculosis como “bait” acoplado a una estrategia de elución secuencial. Paralelamente realizamos abordajes proteómicos comparativos y cuantitativos, DIGE y “shot gun”, usando la cepa salvaje de M. tuberculosis (WT) y una cepa “knock out” en el gen pknG (KO). La estrategia interactómica nos permitió identificar potenciales sustratos e interactores de esta enzima, que participan en el control del metabolismo del nitrógeno y la división celular. Mediante la aproximación DIGE se detectaron spots que presentaron un perfil consistente con cambios en el estado de fosforilación de proteínas, y fueron identificadas como potenciales sustratos de PknG. Por otro lado, usando la aproximación tipo “shot-gun” se detectaron una serie de proteínas diferenciales, las cuales serían fundamentales para la sobrevida de la bacteria en el hospedero. Asimismo, el análisis de estos datos nos permitió determinar que el metabolismo de la pared celular y la adaptación a la hipoxia fueron los procesos biológicos principalmente afectados por la ausencia de PknG. Por lo tanto, a partir de este trabajo pudimos identificar potenciales sustratos de PknG los cuales cumplen un papel central en el metabolismo de la bacteria y determinamos que la ausencia de PknG en M. tuberculosis afecta procesos de gran relevancia para su patogenicidad.

Contacto: alima@pasteur.edu.uy
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Resumen:
La Antártida es una fuente inagotable de recursos genéticos para el desarrollo de productos biotecnológicos. Un ejemplo podrían ser las levaduras capaces de degradar polisacáridos a bajas temperaturas, útiles para el desarrollo de procesos de sacarificación y fermentación a bajas temperaturas para la producción de bioetanol. En un trabajo anterior, nuestro equipo de trabajo aisló levaduras que formarían parte de la microbiota del oligoqueto antártico Grania sp. Las levaduras se identificaron en forma molecular como integrantes de los géneros Rhodotorula y Cystobasidium. Estos microorganismos mostraron actividad celulolítica y esterolítica, lo cual dejó abierta la posibilidad de su uso durante los procesos de producción de bioetanol y biodiesel. El objetivo del trabajo acá presentado fue ampliar la colección de levaduras antárticas con potencial celulolítico, identificarlas y analizar su capacidad de realizar fermentación etanólica utilizando glucosa como sustrato. Se trabajó con muestras de diferentes zonas geográficas de la Península Fildes, Isla Rey Jorge, Antártica, y se aislaron 11 levaduras con diferencias morfológicas. Se analizó su capacidad de producir celulasas y amilasas en medio sólido, a 10 °C. Cinco de éstas levaduras presentaron actividad celulasa y solo una mostró actividad amilasa. Los próximos ensayos estarán focalizados a la identificación molecular por amplificación, secuenciación y análisis de los dominios D1/D2 del gen 26S rDNA. Además, se analizará su habilidad para producir etanol por GC-FID. Se espera que estos resultados contribuyan a las líneas de investigación de nuestro laboratorio, con miras al desarrollar proyectos de interés para la industria de los biocombustibles.

Contacto: flaureano@fcien.edu.uy
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Resumen:
Las glutarredoxinas se encuentran presentes en organismos de todos los reinos. Son proteínas pequeñas, de aproximadamente 80 a 120 aminoácidos que presentan un plegamiento tipo tiorredoxina y un sitio activo CXXC/S. Algunas, son oxidorreductasas activas en reacciones de intercambio tiol-disulfuro, mientras que otras utilizan sustratos como el glutatión para la biogénesis de centros Fe-S. En este trabajo se profundiza sobre la reactividad de dos glutarredoxinas humanas: HsGrx2 y HsGrx5. La primera, es activa en reacciones de intercambio tiol-disulfuro, mientras que la última no. A raíz de esto, se plantea identificar el origen de las diferencias funcionales en estas proteínas que son muy similares a nivel de secuencia y estructura. Para ello, ambas se someten a ensayos de reactividad nucleofílica, actividad enzimática y determinaciones de pKa de residuos de cisteína catalíticamente relevantes. Los ensayos de reactividad nucleofílica, apuntan al estudio cinético de la reacción de sustitución nucleofílica, entre los tioles de cisteína y dos electrófilos: el monobromobimano (mBBr) y un disulfuro de glutatión derivatizado con fluoresceína. Para evaluar la actividad de intercambio tiol-disulfuro, se siguió la reacción entre la proteína y un disulfuro mixto de glutatión y mercaptoetanol, acoplada al consumo de NADPH por glutatión reductasa. El pKa se determinó mediante distintas técnicas, observando: la absorbancia del tiolato (S^-) a 240 nm, el corrimiento del centro de masa del espectro de emisión del triptofano y las velocidades iniciales de reacción con mBBr; todo, a distintos valores de pH. No se observaron diferencias significativas en la acidez de las cisteínas catalíticas, ni en la reactividad con el sustrato inespecífico (mBBr), entre ambas proteínas. En cuanto al sustrato específico (GSSG) se observó que la reacción para la HsGrx2 resultó ser cien mil veces más rápida que para la HsGrx5; y que HsGrx5 no presenta actividad enzimática como tiol-disulfuro oxidorreductasa a diferencia de HsGrx2.

Contacto: sebastianvillar210@gmail.com
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Resumen:
Las proteínas Moonlighting o multitareas son aquellas proteínas con dos o más funciones realizadas por una sola cadena polipeptídica. Estas proteínas presentan funciones alternativas (llamadas canónicas y “moonlighting”) que tienen lugar al cambiar la localización celular, el tipo de célula, el estado oligomérico, la concentración de ligandos celulares, los sustratos, los cofactores, los productos o las modificaciones postraduccionales. Generalmente, estas proteínas se revelan experimentalmente por serendipia. La aparición de una nueva función puede convertirse en una ventaja para la célula o el organismo porque les permite reducir el número de genes y las proteínas correspondientes que tienen que ser sintetizados, haciendo su genoma más compacto y también permitiendo coordinar las actividades celulares. Pero su presencia también complica la interpretación de knock-outs, knock-ins, ADN arrays, metabolómica, análisis de biología de sistemas, farmacocinética, farmacodinámica y ensayos de toxicidad, etc. Aunque su presencia permiten explicar, en parte, el reducido número de genes de nuestro genoma también introduce nuevas fuentes de pleiotropía, que implicará repensar algunos aspectos de la evolución de los sistemas vivos. Muchas de las proteínas identificadas con estas características pertenecen a vías que podríamos llamar "ancestrales", es decir, enzimas del metabolismo primario, receptores, chaperonas, etc. y muchas de sus funciones secundarias están relacionadas con transducción de señales, regulación de la transcripción, cambio de estado celular, patogeneicidad, etc. En este trabajo, nos aproximamos a este conjunto de proteínas explorando algunos aspectos de cómo se pudieron generar y algunas de sus particularidades a la hora de tratar de identificar estas funciones por métodos bioinformáticos, revelando que los mejores métodos bioinformáticos son los que combinan el análisis de homología con los datos de interactómica.

Contacto: jcedano@unorte.edu.uy
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Resumen:
El peroxinitrito (ONOO^?/ONOOH), producto de la reacción controlada por difusión  (k ~ 10¹⁰ M⁻¹ s⁻¹) entre los radicales superóxido (O₂^•?) y óxido nítrico (^?NO) es una especie de vida media muy corta, que ha sido identificado como un agente citotóxico con gran poder oxidante y nitrante. Es considerado un mediador patogénico en situaciones de estrés nitrooxidativo, involucrado en afecciones como inflamación y enfermedades cardiovasculares. En los últimos años la disfunción mitocondrial ocasionada por estrés nitrooxidativo ha sido implicada en la patogénesis de varias enfermedades neurodegenerativas.  Existe una necesidad de desarrollar sondas  para la detección y estimación de la velocidad de formación de peroxinitrito en mitocondrias, uno de los sitios celulares principales de su formación. Este tipo de sondas puede aportar información fundamental para entender cómo los oxidantes derivados del óxido nítrico afectan procesos biológicos, incluyendo la disfunción mitocondrial y señalización de la muerte celular. Los aril-boronatos reaccionan rápida y estequiométricamente con ONOO^? para dar el correspondiente compuesto hidroxilado como producto principal. En sistemas celulares donde coexisten varias especies reactivas de oxígeno y nitrógeno, los boronatos son cinéticamente selectivos para la reacción con peroxinitrito (k ~ 1 x 10⁶ M^-1s^-1). Recientemente hemos reportado la validación de una sonda fluorescente derivada de éster borónico para la detección directa de peroxinitrito producido endógenamente. Estos datos nos permitieron modificar estructuralmente los derivados arilborónicos para avanzar hacia la identificación de los sitios subcelulares y las velocidades de generación de peroxinitrito. En este trabajo se presenta el diseño, la síntesis y la caracterización de la nueva sonda fluorescente derivada de arilboronatos, MitoCT (Mito-cumarintriazol), dirigida a la matriz mitocondrial para la detección directa de peroxinitrito.

Contacto: qfnrios@gmail.com
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Resumen:
Las sirtuinas, proteínas desacetilasas dependientes de NAD⁺, son factores clave en la regulación del metabolismo, la inflamación y respuesta al estrés. En particular, la sirtuina 6 humana (hSIRT6) es conocida como desacetilasa de histona 3 a pesar de poseer baja actividad in vitro. Se ha reportado que dicha actividad se incrementa en presencia de ácidos grasos libres y que a su vez posee actividad deacilasa de ácidos grasos de cadena larga. Los estudios en la regulación de hSIRT6 son escasos. Nuestro objetivo es investigar la potencial regulación redox de hSIRT6 caracterizando cambios estructurales y funcionales bajo condiciones oxidantes. hSIRT6 recombinante fue expresada y purificada de E. coli. La actividad desacetilasa se midió usando un ensayo enzimático acoplado monitoreando el consumo de NADPH a 340 nm, utilizando como sustrato un péptido de histona 3 sintético acetilado (H3K9Ac). Los tioles de la enzima fueron oxidados luego de tratamientos con H₂O₂ y peroxinitrito, sin embargo la actividad desacetilasa únicamente se vio afectada en exceso de peroxinitrito. Se determinó la formación de un disulfuro intermolecular en el cual es altamente probable que participe la C320. Se confirmó el incremento de la actividad desacetilasa en presencia de ácido oleico (OA), incremento que no se constata cuando la enzima es previamente incubada con el nitroalqueno derivado del OA (NO₂OA). La hipótesis de que el NO₂OA se une covalentemente a hSIRT6 fue refutada mediante ensayos de competencia. La identificación de los residuos aminoacídicos modificados por los tratamientos oxidantes y ácidos grasos se realizará mediante espectrometría de masas.

Contacto: maracarreno@gmail.com
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Resumen:
La enfermedad de Chagas, causada por el protozoario Trypanosoma cruzi, constituye un problema sanitario en Latinoamérica y ha sido declarada por la Organización Mundial de la Salud como “enfermedad tropical desatendida”. Trypanosoma cruzi es capaz de invadir varios tipos celulares en el hospedador mamífero, desplegando diferentes moléculas y diversos mecanismos, muchos de los cuales aún se desconocen, asegurando su invasión y persistencia. Buscando en la base de datos de su genoma hemos identificado genes para proteínas con motivos repetidos ricos en Leucina (LRR), los cuales no presentan claras homologías con secuencias de proteínas de mamíferos. Dichas proteínas han sido poco estudiadas en T. cruzi, a pesar de que se conoce que en otros organismos participan en importantes funciones tales como interacción célula-célula, transducción de señales, reordenamiento del citoesqueleto, virulencia y señalización celular, haciéndolas así un blanco atractivo para su estudio. Nos propusimos estudiar si algunas de estas proteínas tienen algún rol en la interacción de T. cruzi con las células hospedadoras y en la invasión y persistencia de la infección. Hemos obtenido parásitos sobreexpresantes de una de estas proteínas y hemos analizado su influencia en el crecimiento del estadío epimastigota del insecto, estudiado su localización subcelular por microscopía de fluorescencia y Western Blot, y determinado su influencia en el proceso infectivo mediante ensayos de infección in vitro. Los resultados obtenidos indican que esta proteína se encuentra asociada al citoesqueleto, su sobreexpresión no genera cambios significativos en la capacidad replicativa del estadío epimastigota, pero aumenta en pequeña medida su capacidad infectiva. Los datos generados hasta la fecha nos indican, por lo tanto, que esta proteína puede estar participando en procesos asociados a la dinámica del citoesqueleto del parásito, los cuales podrían determinar la capacidad infectiva del mismo.

Contacto: fmatto@fcien.edu.uy
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