Resumen:
Los ratones Tr-J, modelo murino de Charcot-Marie-Tooth1E (CMT1E), principal neuropatía periférica humana, presentan junto a esta afección, una parálisis espástica y un temblor generalizado (presente desde los 11 días  de vida), que podría indicar un compromiso central. La PMP22 ha sido descrita en algunos sectores del cerebro, en el tronco encefálico y en motoneuronas espinales de ratas y ratones. Sin embargo, ni la expresión del gen normal ni la del mutado han sido aun claramente establecidas en el SNC. Se ha demostrado además, que pacientes portadores de neuropatías hereditarias presentan desmielinización de la sustancia blanca. Previamente,  observamos niveles de pmp22 y su proteína, PMP22, incrementados en el citoplasma y núcleo de neuronas hipocampales y de Purkinje en TrJ respecto del wt. En el presente trabajo evaluamos el fenotipo neurodegenerativo TrJ en la región de la Sustancia Nigra (SN), con dos abordajes: 1) mediante  inmunomicroscopía confocal cuantitativa (para los marcadores PMP22, p53, melan A, Tau-1, actina, neurofilamento) y 2) a través de la cuantificación de neurotrasmisores por HPLC. La expresión del fenotipo neurodegenerativo TrJ se manifiesta a nivel de la SN, en la expresión diferencial de PMP22, p53 y Tau-1 y en los niveles de Dopac y dopamina. El fenotipo central muestra también en TrJ una regresión en el desarrollo y distribución de la vasculatura, junto a una notable estenosis. Esta alteración podría indicar, junto al hallazgo, en TrJ, de niveles reducidos del ARNm del citocromo b y alteraciones en los niveles de ADN mitocondrial (que hemos realizado recientemente),  la existencia de un  metabolismo oxidativo alterado asociado al fenotipo neurodegenerativo. Una exploración de la actividad mitocondrial, podría permitir determinar la repercusión funcional de tales alteraciones. Estos hallazgos sugieren un compromiso sistémico del Sistema Nervioso, cuyas consecuencias podrían modificar el alcance y la comprensión del síndrome CMT.

Contacto: monicabube@gmail.com
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Resumen:
La Aromatasa B y la NADPH-citocromo P450 reductasa son enzimas de la ruta esteroidogénica que convierten los andrógenos en estrógenos. Diversos estudios reportan altos niveles de expresión de Aromatasa B en la glía radial y gran producción de estrógenos, los que están implicados en la proliferación celular. Estas características pueden representar una adaptación ligada a la neurogénesis continua que se sabe que ocurre a lo largo de toda la vida de los peces. Se ha observado que la actividad NADPH-diaforasa en el encéfalo de los peces está presente en neuronas nitrinérgicas y también en células gliales posiblemente dada por la actividad de la reductasa esteroidogénica. El objetivo de este estudio es analizar mediante inmunorreactividad la presencia de Aromatasa B y la marcación mediante histoquímica de las células con actividad NADPH-diaforasa en el encéfalo del pez teleósteo Austrolebias charrua. Estos marcadores se analizaron en combinación con bromodesoxiuridina (BrdU) como marcador de proliferación celular para determinar si las células Aromatasa B+ y NADPH diaforasa+ son proliferantes. El análisis por microscopía óptica y confocal mostró que algunas células radiales ubicadas en las zonas ventriculares presentan actividad NADPH-diaforasa, inmunorreactividad frente a la aromatasa B y son BrdU+. También se detectaron más profundas en el parénquima, neuronas nitrinérgicas con actividad NADPH-diaforasa. En diferentes protocolos de estudio, se pudo constatar la colocalización de BrdU con células NADPH-diaforasa+ y  con células Aromatasa B+; y que algunas células radiales presentan doble marcado para la Aromatasa B y la actividad NADPH-diaforasa. Estos resultados presentan a las glías radiales de Austrolebias charrua como células proliferantes con actividad esteroidogénica y con actividad NADPH-diaforasa probablemente resultado de la enzima reductasa de la ruta esteroidogénica.

Contacto: maxitorres-tdd@hotmail.com
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Resumen:
INTRODUCTION: The endoplasmic reticulum (ER) is fundamental for membrane trafficking and secreted protein synthesis in eukaryotic cells. Membrane-bound ribosomes transfer proteins to the ER lumen for subcellular targeting or secretion. Passive diffusion is believed to be the predominant mechanism for protein transport in the ER. However, since the ER is a continuous network that undergoes major structural changes, we assess the structural dynamics as an additional mechanism to control transport of luminal proteins. MATERIALS AND METHODS: ER in COS-7 cells was visualized by spinning-disk optical microscopy using transfected mRFP-KDEL or mMaple-KDEL. We modified structural-dynamics through pharmacological treatments that alter cytoskeleton stability, molecular motors, and the energetic metabolism. Through analysis of fluorescence fluctuation, we formulate a dynamics index based on autocorrelation and computational simulations. Protein transport was examined by fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) and single molecule tracking (SMT), obtaining a diffusion coefficient (D). We evaluated variations in D after modifying the structural-dynamics of the ER network by different drugs. RESULTS: Measurements of D indicate that diffusion of luminal proteins in single tubules is slower than in larger regions (microns), and increased with the ER-dynamics, But does not change with network-structure or cell morphology. DISCUSSION: We propose that the ER-dynamics generated by local cytoskeletal modifications is an active transport mechanism which, in addition to passive diffusion, is involve in the transport of ER luminal proteins.

Contacto: jorgetoledoh@gmail.com
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Resumen:
In recent years, the use of optical microscopy and medical image processing has become increasingly relevant for research and medical practice. In vivo microscopy has contributed to the study of cellular structure and function with previously unattained resolution, setting a basis for a deeper understanding of diseases like Cancer, Alzheimer, or Parkinson. Common goals of computational methods for image processing in this context are the quantification of static or dynamic structures either at cellular level, like nuclei or membranes, or at tissue level. Typical analysis tasks are shape description, and tracking, whose combination leads to dynamics quantification. The new generation of high-throughput optical microscopy operating now in South America includes lightsheet microscopy, super resolution techniques such as PALM, STORM, and automated acquisition setups (tissue scanner, multi-well). These technologies generate large volumes of data with specific optical characteristics which make proper image processing methods critical for the efficient extraction of relevant information. In this talk, I will show current work of our lab in deploying storage and network technologies available to local researchers to promote cutting edge collaborative works at the intersection of Cell Biology, Microscopy, and Image Processing. Examples of these efforts are: large-scale cell tracking in development biology, neuron structure automated descriptions, subcellular protein and cytoskeleton dynamics quantification. Acknowledgement: MC Laboratory is funded by FONDECYT 11161033, CONICYT PIA ACT1402, ICM P09-015-F, CORFO, and DAAD (57220037 & 57168868).

Contacto: mauriciocerda@med.uchile.cl
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Resumen:
During fetal life many programming factors such as subnutrition are able to modify the intrauterine environment determining permanent changes in adult life. Concerning reproduction, growth factors such as glial cell derived neurotrophic factor (GDNF) emerge as a potential factor that could mediate these adjustments. GDNF is known to regulate the decisions of the cellular fate of the spermatogonial stem cells (SSC) through a paracrin regulation. It is not yet determined whether subnutrition during developmental windows periods modulates the expression of this factor. Therefore, the objective was to determine whether subnutrition during pregnancy (UNP), lactation (UNL) or pregnancy / lactation (UNPL) modify GDNF expression in the adult testis. Testicular rat’s samples were processed and immunohistochemical technique using rabbit polyclonal anti GNDF was performed. Immunostaining area and intensity of GDNF immunoexpression (%) were measured. In addition, frequency of stages of the seminiferous cycle was determined and correlated with GDNF immunoexpression. In all cases, significance were considered to be P <0.05. The percentage of immunostaining area and the intensity of GDNF immunostaining were higher in the UNP and UNL group compared to the control group (p <0.0001). Our results showed an overexpression of GNDF during stage VII and VIII. Normally, GDNF protein is secreted by Sertoli cells maximized between XIII-I of spermatogenic stage cycle, and decreasing towards stage VII. Previous studies in mice demonstrate that testes over expressing GDNF were infertile, and develop testicular tumors. A complex process, the spermiation occurs at the beginning of stage VII in the rat, and is completed towards the end of stage VIII. Consequently, we suggest that subnutrition during lactation, and pregnancy modified GDNF expression that disturb spermatogenesis, particularly at stages were spermiation occurs within seminiferous cycle in adult animal testes. In conclusion, subnutrition during key periods of development increased GDNF with deleterious consequences on spermatogenesis.

Contacto: gpedrana@gmail.com
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Resumen:
El neurodesarrollo y las células neurales son blancos preferenciales de la deficiencia de hierro (DH) y del alcohol. La DH es la condición nutricional más prevalente afectando fundamentalmente a mujeres en edad fértil y sus hijos desde la gestación hasta la adolescencia temprana. Por su parte, el consumo abusivo de alcohol es responsable del 1% de las enfermedades neonatales no atribuibles a causas genéticas y de casi el 6% de las muertes mundiales. La DH y el alcohol alteran irreversiblemente al sistema nervioso central. Sin embargo son poco conocidos sus efectos combinados sobre las células gliales que son determinantes para la perpetuación del daño al SNC. Nuestro grupo ha analizado los efectos de DH-alcohol exponiendo astrocitos corticales neonatales al quelante de hierro desferroxamina (DFO, 25 µM, 96 h) y a etanol (100 mM, 24 h) y luego co-cultivado con neuronas y oligodendrocitos. La coexistencia DFO-alcohol provocó una disminución significativa del potencial y la funcionalidad mitocondrial además de un descenso en los niveles de glutatión en astrocitos. Sin embargo, DFO-alcohol bloqueó el aumento de estrés oxidativo producido por alcohol y las alteraciones del citoesqueleto de actina ocasionadas por DFO. La sobrevida de neuronas hipocampales co-cultivadas sobre astrocitos DH-alcohol fue la menor de todas las condiciones (80% del control). DFO y DFO-alcohol disminuyeron la sobrevida de oligodendrocitos en igual porcentaje, pero DFO-alcohol afectó además la morfología de los oligodendrocitos supervivientes. Nuestros resultados muestran que la DH y el alcohol alteran el fenotipo astrocitario actuando sinérgicamente sobre algunas respuestas y antagonizando otras. Sin embargo, la co-existencia DH-alcohol en astrocitos tuvo la mayor repercusión negativa sobre la viabilidad de neuronas y oligodendrocitos, lo que podría explicar el agravamiento de los efectos negativos sobre la sinaptogénesis y la mielinización cuando coexisten ambas condiciones.

Contacto: solivera2011@gmail.com
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Resumen:
El análisis de células mediante microscopía óptica (MO) es utilizado en diversas áreas de enseñanza, diagnóstico e investigación. Durante años el análisis cuantitativo y cualitativo de células al MO se realizó manualmente pero actualmente es posible realizarlo mediante algoritmos programables manipulando grandes cantidades de datos en poco tiempo. En el 2016 se realizó una actividad de Extensión en el Liceo N2 de Minas, Lavalleja con el objetivo de aproximar a estudiantes de secundaria a las técnicas histológicas de rutina y al análisis microscópico de las células.En esta experiencia se observaron y analizaron frotis de sangre. La actividad tuvo muy buena recepción por parte de los participantes, sin embargo, los docentes manifestaron que la identificación manual de células al MO conlleva un tiempo considerable. Si bien actualmente existen programas comerciales que detectan automáticamente variedades celulares, estos son muy costosos y no se encuentran disponibles rutinariamente.En este trabajo proponemos validar variables cuantitativas y cualitativas de reconocimiento celular, a través de imágenes obtenidas con MO. Se utilizaron frotis de sangre teñidas con técnicas histológicas de rutina. Se utilizó un programa de acceso libre (FIJI). Las variables seleccionadas para reconocer las células fueron: forma, contraste, tamaño de núcleo y contraste del citoplasma de neutrófilos. Los resultados preliminares muestran que existen varias posibilidades que permiten contabilizar variedades celulares. Una herramienta del programa contabiliza múltiples tipos celulares de forma manual. Este procedimiento no difiere de los utilizados actualmente por lo que no implicaría un gran impacto. Otra herramienta semi automatizada que brinda FIJI son los Macros, que permitan el análisis de ¨partículas¨. El operador la programa y luego puede ser reproducida en diversas imágenes obteniendo resultados muy similares.Concluimos que esta segunda herramienta permitiría optimizar tiempos y estandarizar procesos, no solo dentro del área biológica sino también en otros campos de estudio.

Contacto: erikwini21@gmail.com
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